第一部分aPKCι促进Nrf2蛋白累积并抑制胆囊癌细胞内ROS水平目的:研究在正常条件下和氧化应激状态下aPKCι对胆囊癌细胞内ROS水平的调节作用,初步探讨aPKCι与Nrf2蛋白表达的相关性。方法:构建aPKCι过表达和靶向沉默的慢病毒载体,分别感染胆囊癌细胞NOZ和GBC-SD以获得稳定细胞株。采用western blot和qRT-PCR方法检测各组稳定细胞中aPKCι的蛋白质和m RNA表达水平。采用DCFH-DA探针法检测不同aPKCι表达水平或吉西他滨处理后的胆囊癌细胞内ROS水平的变化。检测aPKCι激酶抑制剂PSI对aPKCι活性和Nrf2蛋白水平的影响。构建携带Flag标签的激酶失活型(KI)、持续激活的催化结构域(CAT)突变体,采用western blot方法检测各组细胞中总Nrf2蛋白和磷酸化Nrf2蛋白的表达。再运用western blot和qRT-PCR方法检测aPKCι对Keap1、Nrf2及其下游靶基因表达的影响。分别提取各组稳定细胞中的浆蛋白与核蛋白,检测aPKCι、Keap1、Nrf2蛋白在细胞浆、细胞核内的分布。在aPKCι过表达胆囊癌细胞中靶向沉默Nrf2表达后,采用DCFH-DA探针法检测细胞内ROS水平的变化。结果:外源性过表达aPKCι显著降低了胆囊癌细胞内的ROS水平,而沉默aPKCι后细胞内ROS水平升高,恢复aPKCι表达能够抑制ROS水平的升高。过表达aPKCι能够抑制吉西他滨诱导的ROS增加,沉默aPKCι后增强了吉西他滨诱导的氧化应激效应。抑制aPKCι激酶活性不影响aPKCι对细胞内ROS和Nrf2蛋白水平的调节作用,aPKCι不能使Nrf2蛋白发生磷酸化。高表达aPKCι促进Nrf2蛋白富集、核转位,并激活Nrf2下游靶基因的表达。但aPKCι不影响Keap1的表达水平。敲低Nrf2表达能够逆转aPKCι对细胞内ROS的抑制作用。结论:aPKCι以非激酶依赖的方式促进Nrf2蛋白的累积、核转位,并通过Nrf2介导的抗氧化应激信号调控胆囊癌细胞内的ROS水平。第二部分aPKCι与Nrf2竞争性结合Keap1的分子机制目的:研究aPKCι与Keap1-Nrf2复合物的调控关系及其分子机制。方法:用蛋白酶体抑制剂MG132处理aPKCι沉默后的胆囊癌细胞NOZ,通过western blot检测Nrf2蛋白水平的变化。运用免疫沉淀技术,检测aPKCι过表达或沉默后,胆囊癌细胞内源性Nrf2的泛素化水平。然后在aPKCι过表达的胆囊癌细胞中靶向沉默Keap1,检测Nrf2蛋白表达水平。构建携带标签的p Enter-Flag-aPKCι和p Enter-Myc-Keap1过表达质粒,转染至HEK293细胞后,采用免疫共沉淀方法检测标签蛋白的表达情况。采用免疫共沉淀方法,在过表达或沉默aPKCι的胆囊癌细胞中,检测aPKCι-Keap1与Keap1-Nrf2结合量的变化;同时研究在氧化应激条件下,吉西他滨对aPKCι-Keap1-Nrf2复合物的影响。应用蛋白质体外合成和免疫共沉淀实验研究aPKCι、Keap1、Nrf2三者之间的结合关系。以野生型Flag-aPKCι为模板,构建一系列aPKCι突变体,与野生型Myc-Keap1质粒共转染至HEK293细胞;再以野生型Myc-Keap1为模板,构建Keap1缺失突变体,与野生型Flag-aPKCι质粒共转染至HEK293细胞,然后运用免疫共沉淀技术分析上述各组细胞中aPKCι与Keap1的结合位点。结果:蛋白酶体抑制剂MG132能够逆转敲低aPKCι导致的对Nrf2蛋白的抑制作用。过表达aPKCι明显抑制Nrf2蛋白的泛素化水平,而aPKCι沉默后,Nrf2蛋白泛素化水平进一步升高。aPKCι调节Nrf2蛋白水平需要依赖Keap1蛋白。敲低内源性Keap1能够降低aPKCι过表达诱导的Nrf2蛋白累积。在正常条件下,aPKCι与Keap1蛋白存在相互结合的关系。过表达aPKCι使aPKCι-Keap1结合量增加,Keap1-Nrf2结合量减少;而敲低aPKCι后,Keap1-Nrf2结合量进一步增加。在吉西他滨诱导的氧化应激状态下,aPKCι与Keap1蛋白结合量增多,而Keap1与Nrf2蛋白结合量减少。在体外蛋白质合成系统中,随着aPKCι蛋白水平增加,aPKCι-Keap1结合量逐渐增加,而Keap1-Nrf2结合量逐渐减少。DLL基序缺失或点突变的aPKCι不能与Keap1结合,而DGR结构域缺失的Keap1亦不能与aPKCι结合。结论:aPKCι通过DLL基序与Nrf2竞争性结合Keap1,从而抑制Nrf2泛素化降解,使Nrf2蛋白累积。第三部分aPKCι介导的ROS抑制促进胆囊癌细胞生长与化疗耐药目的:研究aPKCι对胆囊癌细胞生长能力和吉西他滨耐药性的影响。方法:利用CCK-8法检测不同aPKCι表达水平时胆囊癌细胞的增殖能力。采用软琼脂克隆形成实验检测aPKCι对胆囊癌细胞锚定非依赖性生长能力的影响。通过裸鼠皮下成瘤实验比较过表达、沉默aPKCι后胆囊癌细胞的体内生长能力。然后进一步研究沉默aPKCι、Nrf2后胆囊癌细胞对吉西他滨敏感性的变化,并用CCK-8法检测吉西他滨在不同浓度、不同作用时间下对胆囊癌细胞增殖能力的影响。DCFH-DA探针法检测aPKCι、Nrf2对吉西他滨诱导的ROS水平升高的影响。Western blot和qRT-PCR法检测沉默aPKCι对吉西他滨诱导的氧化应激状态下Nrf2蛋白及其靶基因表达的影响。再利用裸鼠皮下移植瘤模型,研究抑制aPKCι后吉西他滨对胆囊癌细胞成瘤能力的影响。将野生型aPKCι、DLL缺失突变体、DLL点突变体质粒转染至aPKCι沉默的胆囊癌细胞,检测Nrf2及其靶基因的表达。同时用前述方法检测胆囊癌细胞的增殖能力、对吉西他滨的敏感性以及细胞内ROS水平的变化。结果:过表达aPKCι显著促进胆囊癌细胞的增殖能力,沉默aPKCι则抑制细胞的增殖,恢复aPKCι表达后,胆囊癌细胞的增殖能力再次提高。aPKCι促进胆囊癌细胞的锚定非依赖性生长和体外成瘤能力,沉默aPKCι后则表现抑制作用。抑制aPKCι能使吉西他滨诱导的细胞内ROS水平进一步升高,增强胆囊癌细胞对吉西他滨的敏感性。在氧化应激条件下,抑制aPKCι降低了Nrf2蛋白及其下游靶基因的表达水平。靶向沉默aPKCι能增强吉西他滨对胆囊癌细胞体外成瘤的抑制作用。DLL缺失或突变后不能恢复沉默aPKCι导致的生长抑制和增加吉西他滨敏感性的生物学作用。结论:aPKCι以DLL基序为基础,介导胆囊癌细胞ROS抑制、促进胆囊癌细胞生长和吉西他滨耐药。第四部分aPKCι、Nrf2、Keap1在胆囊癌组织中的表达及临床意义目的:检测aPKCι、Nrf2、Keap1在胆囊癌组织中的表达,进一步结合临床资料分析aPKCι表达与临床病理因素的相关性。方法:收集72例胆囊癌病人的手术标本,采用免疫组织化学染色技术检测aPKCι、Nrf2、Keap1在胆囊癌组织及配对的正常胆囊组织中的表达,采用Spearman分析法分析三者之间的表达水平的关系。再选取代表性的胆囊癌组织标本,采用western blot和qRT-PCR方法从蛋白质、m RNA水平检测aPKCι、Nrf2、Keap1的表达。运用Kaplan-Meier法分析aPKCι表达与胆囊癌病人临床预后的相关性。采用Cox多因素回归分析法分析胆囊癌病人预后的独立危险因素。结果:在72例胆囊癌组织标本中,aPKCι、Nrf2在癌组织中表达水平明显高于正常胆囊组织,且两者之间有明显的相关性。在aPKCι高表达(49例)的标本中,有77.6%(38例)呈Nrf2表达上调;而23例aPKCι低表达的标本中,65.2%(15例)的样本中Nrf2表达下调(P<0.01)。Keap1在癌组织和正常组织中的表达无明显差异,aPKCι与Keap1的表达水平没有显著相关性。在代表性胆囊癌组织标本中,aPKCι、Nrf2在癌组织中的表达水平高于正常组织;Nrf2、Keap1的m RNA水平在癌组织和正常组织之间没有明显差异,但aPKCι和Nrf2的靶基因m RNA水平在胆囊癌组织中明显上调。aPKCι表达水平与胆囊癌病人TNM分期、淋巴结转移、肿瘤分化程度及病人总生存期相关。Cox回归分析显示aPKCι是胆囊癌病人预后的独立危险因素。结论:aPKCι在胆囊癌组织中表达上调,且与Nrf2蛋白及其靶基因的上调呈正相关。aPKCι与胆囊癌进展、临床预后密切相关,是胆囊癌病人预后的独立危险因素。