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研究背景乳腺癌是世界范围内最常见的女性恶性肿瘤,根据病理学的诊断结果可以分为不同的亚型。其中三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancers,TNBC）是指雌激素受体、孕激素受体以及人类表皮生长因子受体2这三者均为阴性的一种乳腺癌亚型,具有发病年龄早、转移率和死亡率高、预后差的特点,因而受到了临床医生和科研工作者的重视。由于缺乏治疗靶点,TNBC患者不能从内分泌治疗和靶向治疗中获益。因此,深入探究TNBC的生物学行为并阐明其分子机制,将有助于寻找TNBC早期诊断和靶向治疗的新型分子标志物,开启TNBC个体精准治疗的新篇章。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类3’和5’末端共价连接的单链RNA分子,具有表达丰度高、保守性高、稳定性强等特点,且在各种生理病理过程中发挥了重要的功能。CircRNA的作用机制主要有以下3类:（1）吸附miRNA阻断其对下游靶基因的抑制作用;（2）与蛋白结合影响其活性与功能;（3）编码产生具有功能的多肽。近年来circRNA在恶性肿瘤的增殖转移、血管新生、能量供应、免疫逃逸和化疗耐药等多个过程中的重要生物学功能受到了研究者的广泛关注。因此,以circRNA为切入点阐明TNBC进展转移的分子机制,有望为TNBC的诊疗开辟新的途径。为了寻找与乳腺癌相关的circRNA,我们对乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织进行了高通量测序,从中筛选出在乳腺癌组织中高表达的circEIF3H作为深入研究的对象。由于circEIF3H在TNBC中的表达量明显高于其他乳腺癌亚型,因此我们聚焦于circEIF3H在TNBC中的作用机制及功能研究。首先我们证实了 circEIF3H的环状特性和临床预后意义,之后我们深入解析了 circEIF3H的分子调控通路,最后通过体内和体外实验明确了 circEIF3H-IGF2BP2/HuR-HSPD1/RBM8A/G3BP1 轴在 TNBC 进展转移中的生物学功能。本课题的完成为TNBC的预后评估和开发新型分子治疗靶点提供了坚实的理论依据,具有重要的临床价值。第一部分 乳腺癌相关circRNA的筛选及鉴定研究目的1.利用高通量测序筛选乳腺癌相关的circRNA。2.检测circEIF3H在乳腺癌组织中的表达情况。3.分析circEIF3H的临床意义和预后价值。4.验证circEIF3H的存在及其环状特性。研究方法1.对乳腺癌组织和癌旁组织进行高通量测序,筛选出与乳腺癌相关的circRNA。2.收集乳腺癌患者的组织标本并对其进行临床随访。通过实时定量PCR（Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR,qRT-PCR）检测组织标本中 circEIF3H 的表达量。3.通过Kaplan-Meier分析circEIF3H的表达水平与乳腺癌患者预后的相关性。4.设计EIF3H的反向和对向引物进行PCR扩增和Sanger测序证实circEIF3H的存在。通过放线菌素D（Actinomycin D,Act D）处理和核糖核酸酶R（Ribonuclease R,RNase R）消化实验检测circEIF3H的半衰期和稳定性。通过UCSC genome browser检索并分析circEIF3H的保守性和潜在的环化机制。研究结果1.对乳腺癌与癌旁组织进行高通量测序后,筛选出81个表达量具有显著差异的circRNA,其中circEIF3H是一个在乳腺癌组织中显著高表达的circRNA。2.70对乳腺癌组织和乳腺组织的qRT-PCR结果显示,circEIF3H在乳腺癌组织中的表达水平高于正常乳腺组织,且4种乳腺癌亚型中circEIF3H在TNBC中的表达量最高。3.CircEIF3H高表达的乳腺癌患者预后不良,且TNBC患者中也有同样的结果。4.PCR扩增实验显示EIF3H的反向引物只能从cDNA模板中扩增出circEIF3H,扩增产物经Sanger测序验证与circEIF3H的反向剪接序列一致。CircEIF3H的半衰期远长于线性EIF3H mRNA的半衰期,且circEIF3H对RNase R具有更高的抗性。UCSC genome browser显示circEIF3H的序列具有较高的进化保守性,且它的侧翼内含子序列中存在可能帮助circEIF3H环化的反向互补序列。研究结论CircEIF3H是一个在乳腺癌组织中,尤其是TNBC组织中高表达的circRNA,且其表达量与乳腺癌患者的预后相关,可作为乳腺癌早期诊断或预后判断的标志物。另外circEIF3H具有稳定性强、半衰期长、保守性高的特性;它的侧翼内含子中的反向互补序列可能促进它的环化。第二部分 CircEIF3H调控分子通路的研究研究目的1.明确circEIF3H的亚细胞定位,据此推测circEIF3H可能的分子机制。2.探究circEIF3H能否通过吸附微小RNA（microRNA,miRNA）发挥作用。3.筛选与circEIF3H结合的蛋白并进行实验验证。4.阐明circEIF3H-IGF2BP2/HuR复合物的下游调控机制。研究方法1.通过核质分离实验和RNA荧光原位杂交（RNAFluorescence in situ Hybridization,RNA-FISH）观察circEIF3H的亚细胞定位。2.开展抗 AGO2 的RNA-结合蛋白免疫沉淀（RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP）实验,明确circEIF3H能否通过吸附miRNA发挥作用。3.利用3’标记生物素的circEIF3H序列进行RNA pulldown实验后对蛋白样品进行蛋白质谱分析,筛选出可能与circEIF3H结合的蛋白,并用RIP实验进一步验证。利用circEIF3H截短序列进行RNA pulldown实验明确circEIF3H与蛋白结合的作用位点。4.分析 IGF2BP2 和 HuR 蛋白的交联免疫共沉淀（Crosslinking immunoprecipitation,CLIP）后RNA测序的数据并对二者取交集,初步筛选出circEIF3H-IGF2BP2/HuR复合物的下游靶基因,之后利用Western blot和RIP实验进一步验证。通过Act D处理TNBC细胞检测RNA的半衰期,探究该复合物对其下游靶基因mRNA稳定性的影响。研究结果1.核质分离实验和RNA-FISH实验均证实circEIF3H主要分布在细胞质中。2.RIP实验显示在AGO2抗体处理过的磁珠拉下的RNA样品中circEIF3H并没有明显的富集,说明吸附miRNA并不是circEIF3H的分子作用机制。3.RNA pulldown实验后的质谱分析检测到IGF2BP2和HuR蛋白的特异性肽段,Co-IP实验证实IGF2BP2与HuR之间存在相互作用,RIP实验证实circEIF3H可以分别与IGF2BP2和HuR相结合。CircEIF3H截短序列的RNA pulldown实验显示circEIF3H与IGF2BP2和HuR的结合位点就是它反向剪接点附近的区域。4.对IGF2BP2和HuR的CLIP-seq数据取交集得到6个候选靶基因,其中有三个基因（HSPD1、RBM8A和G3BP1）的表达量与circEIF3H呈正相关。RIP实验证实这三个靶基因都能与IGF2BP2和HuR蛋白结合,且改变circEIF3H的表达量会影响这种结合作用。干扰circEIF3H的表达后HSPD1/RBM8A/G3BP1的mRNA半衰期明显变短,说明circEIF3H-IGF2BP2/HuR复合物可以调控下游靶基因的mRNA稳定性。研究结论CircEIF3H主要定位于细胞质中,可以通过它的反向剪接点附近的序列与IGF2BP2和HuR这两个蛋白结合形成三元复合物,进而与HSPD1/RBM8A/G3BP1这三个下游靶基因的mRNA结合并提高其稳定性,延长mRNA的半衰期。第三部分 CircEIF3H调控TNBC进展转移的研究研究目的1.探究circEIF3H在TNBC中的功能。2.明确IGF2BP2/HuR在TNBC进展转移中的功能。3.探究HSPD1/RBM8A/G3BP1在TNBC进展转移中的功能。4.证实 circEIF3H-IGF2BP2/HuR-HSPD1/RBM8A/G3BP1 轴在 TNBC 中的作用。研究方法1.CircEIF3H在三阴性乳腺癌中的功能研究。（1）体外实验:在TNBC细胞中过表达或敲低circEIF3H后,进行MTT法、克隆形成实验、流式细胞术检测细胞周期分布和Transwell迁移和侵袭实验。（2）体内实验:建立稳定过表达或敲低circEIF3H的TNBC细胞系,进行皮下注射构建裸鼠皮下荷瘤模型,通过尾静脉注射构建裸鼠肺转移模型,检测circEIF3H在体内对TNBC增殖和转移的影响。2.CircEIF3H-IGF2BP2/HuR-HSPD1/RBM8A/G3BP1 轴在 TNBC 中的促癌作用。（1）IGF2BP2/HuR在TNBC中的功能研究:干扰或过表达IGF2BP2/HuR后通过q RT-PCR和免疫荧光验证转染效率。之后分别利用MTT法和Transwell实验检测TNBC细胞增殖和转移能力的改变。（2）HSPD1/RBM8A/G3BP1 在 TNBC 中的功能研究:转染 HSPD1/RBM8A/G3BP1的siRNAs后行qRT-PCR检测转染效率,之后利用MTT法、EdU和克隆形成实验检测细胞增殖能力,利用Transwell检测转移能力。（3）验证 CircEIF3H-IGF2BP2/HuR-HSPD1/RBM8A/G3BP1 轴在 TNBC 中的功能:体外实验:在TNBC中过表达circEIF3H和/或干扰HSPD1/RBM8A/G3BP1进行挽救实验,通过MTT法、EdU、平板克隆形成和Transwell验证干扰HSPD1、RBM8A和G3BP1对circEIF3H促癌作用的逆转。体内实验:对裸鼠皮下成瘤实验中的肿瘤组织并进行免疫组织化学染色,镜下观察circEIF3H对HSPD1、RBM8A和G3BP1表达水平的影响。临床验证:利用qRT-PCR检测49例乳腺癌组织标本中circEIF3H、HSPD1、RBM8A和G3BP1的表达量并进行相关性分析。研究结果1.干扰circEIF3H后细胞的增殖、迁移、侵袭能力显著下降,S期细胞的比例降低且G1期细胞的比例升高。过表达circEIF3H后则得到了相反的实验结果。2.在TNBC细胞中有效干扰IGF2BP2或HuR后细胞的增殖和转移能力被抑制。3.干扰HSPD1、RBM8A或G3BP1的表达能抑制TNBC细胞的增殖和转移。4.挽救实验从细胞层面证实HSPD1/RBM8A/G3BP1可以逆转circEIF3H对TNBC恶性生物学行为的促进作用;裸鼠皮下荷瘤实验从动物层面证实circEIF3H是通过上调HSPD1/RBM8A/G3BP1在体内发挥促癌功能的;乳腺癌组织标本的qRT-PCR实验从临床层面证实HSPD1/RBM8A/G3BP1的表达水平与circEIF3H成正相关。研究结论CircEIF3H在体内和体外实验中均表现出促进TNBC增殖转移的功能。随后通过细胞学实验、动物实验和临床研究三方面我们发现circEIF3H的这种促癌作用是通过稳定HSPD1、RBM8A和G3BP1的mRNA进而提高其表达水平实现的。