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目的:由人类免疫缺陷病毒(HIV-1)所引起的艾滋病是全世界最重要的公共卫生问题之一。目前抗逆转录病毒药物是控制HIV-1的主要手段,但由于病毒潜伏库的存在,该方法尚不能彻底治愈艾滋病。有研究显示,HIV-1潜伏库的存在与维持与HIV-1启动子5’LTR的CpG岛中的胞嘧啶甲基化有关。我们前期研究证实宿主限制性因子APOBEC3A(A3A)可催化HIV-1启动子CpG岛中的胞嘧啶去甲基化,促进下游蛋白的表达。但A3A催化DNA去甲基化的分子机制尚有待进一步探讨。A3A作为胞嘧啶脱氨酶,能够识别甲基化胞嘧啶(mC),使其脱氨基形成胸腺嘧啶,导致T:G错配。我们推测这一碱基错配可激活下游的碱基切除修复(BER)途径对其进行切除、修复,使mC再次转化为胞嘧啶(C),从而完成mC的去甲基化。为证明这一假设,本研究对BER途径中起关键作用元件,包括DNA糖基化酶:甲基-CpG结构域蛋白4(MBD4)和胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)、Gadd45a进行如下分析,以期揭示A3A参与DNA主动去甲基化的分子机制。方法:1.构建TDG、MBD4敲降及未敲降的293T细胞系(shTDG-293T、shMBD4-293T、shNC-293T)。然后,将pCAGGS-HA-A3A-a(A3A)或pCAGGSHA-A3G(A3G,对照)与甲基化pmeLTR-Luc2P-EGFP或未甲基化pLTR-Luc2PEGFP报告质粒,分别共转染shTDG-293T、shMBD4-293T和shNC-293T细胞,用双荧光素酶实验检测TDG和MBD4的敲降对A3A去甲基化作用的影响。2.分别构建表达TDG和MBD4的重组质粒pCMV-Myc-TDG(TDG)和pCMVMyc-MBD4(MBD4),并分别将A3A与TDG或MBD4共转染293T细胞,用免疫共沉淀实验检测A3A与TDG,A3A与MBD4的结合情况,分析A3A与TDG和MBD4的相互作用。3.构建表达Gadd45a的重组质粒pCAAGGS-FlagGadd45a(Gadd45a),然后将Gadd45a、A3A和TDG,或Gadd45a、A3A和MBD4共转染293T细胞,用免疫共沉淀实验检测Gadd45a存在的情况下,A3A与TDG,A3A与MBD4的结合,探索Gadd45a蛋白在A3A与DNA糖基化酶相互作用中的作用。同时将也Gadd45a与TDG或MBD4共转染293T细胞,分析Gadd45a与DNA糖基化酶的相互作用。结果:1.TDG和MBD4敲降细胞在形态上与阴性对照细胞没有差别。免疫印迹证实,TDG和MBD4敲降细胞内相应蛋白的表达明显降低。与shNC-293T细胞相比,共转染A3A与pmeLTR-Luc2P-EGFP的shTDG-293T和shMBD4-293T细胞的荧光素酶的相对活性均下降,共转染A3G与pmeLTR-Luc2P-EGFP的TDG和MBD4敲降细胞中的荧光素酶的相对活性没有明显变化。2.构建的重组质粒pCMV-Myc-TDG和pCMV-Myc-MBD4分别经EcoR I和Kpn I双酶切之后,电泳获得了与目的片段相同大小的电泳条带,并且测序结果也与预期的一致。将A3A和TDG或MBD4共转染至293T细胞,利用免疫共沉淀,在经Myc抗体沉淀下来的Myc-TDG、Myc-MBD4相互作用蛋白复合物中检测到A3A蛋白。3.构建的重组质粒pCAAGGS-Flag-Gadd45a经Kpn I和Xba I双酶切鉴定,电泳显示条带与预期大小一致,并且测序结果也与预期一致。用抗Myc抗体对Gadd45a、A3A与TDG或MBD4共转染的293T细胞裂解液进行免疫共沉淀,免疫印迹结果显示在Gadd45a蛋白共转染时,与Myc-TDG、Myc-MBD4相互作用的A3A蛋白增加。此外,Gadd45a还可以与TDG或MBD4蛋白共沉淀。结论:1.TDG和MBD4的敲降可以减弱A3A去甲基化作用,表明TDG和MBD4参与了A3A介导的HIV-1启动子去甲基化。2.A3A与BER下游分子TDG和MBD4存在相互作用。3.Gadd45a分子可以增强A3A与TDG和MBD4的相互作用,并且Gadd45a也与TDG和MBD4有相互作用。表明A3A是通过BER途径参与DNA主动去甲基化。