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本实验室从土壤中分离得到一株角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21,为了提高菌株CH21产生抗生素的能力,本论文以菌株CH21为出发菌株进行诱变育种,获得了高产突变株,进一步优化其发酵培养基。论文主要包括以下两章的研究结果:
第一章:产抗生素角毛壳菌CH21的诱变育种
根据角毛壳菌生长特性、抗生素产生时间及其对指示菌的抑制效果,本论文建立了以辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)作为指示菌的双层平板初筛方法,即将诱变孢子液涂布于15 mL PDA平板上,26℃培养3天,再倒入10mL含5%辣椒炭疽病菌的PDA培养基,培养2天,挑选抑菌比较对照株大的菌落进行复筛。该方法能减少工作量,避免随机挑选的盲目性,提高正突变株的检出率。
为了增加孢子对诱变剂的敏感性,提高正突变株的产生机率,本论文选择萌孢子作为诱变材料,研究了菌株CH21孢子的萌发规律。结果发现,萌发3h的孢子芽管长度介于孢子短轴直径的0.5-1倍之间,对诱变剂敏感,不易出现多核现象。用该时期的孢子进行诱变,有利于减少突变表型延迟现象,增加突变菌株的稳定性。
第一轮诱变时,研究了微波辐照时间对菌株CH21萌发3h孢子存活率的影响,选择最佳的微波诱变条件:功率500W、频率2450 MHz、辐照时间15s。在该诱变条件下,对角毛壳菌CH21萌发的孢子进行诱变处理,经初筛和摇瓶复筛,获得3株高产菌株,其中突变株CH21-2发酵液的抑菌圈直径为17.30mm,较出发菌株CH21抑菌圈直径(12.50 ram)增加了38.3%,因此将突变株CH21-2作为第二轮诱变育种的出发菌株。
第二轮诱变时,研究了紫外线照射时间对突变株CH21-2萌发孢子存活率的影响。实验发现,在3600 s的高剂量诱变条件下,仍有12%的孢子稳定存活,表明这部分孢子对紫外线极不敏感。为了提高正突变株的产生机率,本论文首次提出敏感孢子存活率的概念。根据敏感孢子存活率选择最佳诱紫外变剂量:功率15W、照射距离30 cm、照射时间300 s。在该诱变条件下,对菌株CH21-2的萌发孢子进行诱变处理,经初筛和摇瓶复筛,获得5株高产菌株,其中突变株CH21-2-20发酵液的抑菌圈直径最大,为20.20mm,较出发菌株CH21-2抑菌圈直径(17.30mm)增加了17%,比原始菌株CH21抑菌圈直径(12.50 mm)增加了62%。连续传代5次,突变株CH21-2-20发酵液的抑菌圈直径稳定在19.4mm-20.38mm.
第二章:菌株CH21-2-20发酵培养基的优化
由于不同批次土豆会影响角毛壳菌(C.cupreum)产生抗生素的能力,限制其工业化生产,因此本论文根据PDB(马铃薯葡萄糖液体培养基)营养成分,设计了成分清楚、来源稳定、价格低廉、可替代PDB培养基的发酵基础培养基。
此基础上,采用单因素试验系统地考察了碳源、氮源、无机盐及生长因子对菌株产生抗生素的影响,得到较优的培养基组成:20.0 g/L葡萄糖,15.0 g/L可溶性淀粉,3.5 g/L花生饼粉,1.0 g/L KH2P04,1.0 g/L K2HP04。用其培养菌株CH21-2-20,发酵液的抑菌圈直径为26.45mm,较发酵基础培养基(抑菌圈直径19.40 mm)增加了36%。根据单因素试验结果,设计正交试验的各因素及其水平,优化各营养成分的配比,得到最优的发酵培养基:15.0 g/L葡萄糖,20.0g/L可溶性淀粉,5.0 g/L花生饼粉,0.5 g/L KH2P04,1.0 g/L K2HPO4。