功能性油脂是对于一类富含n-3多不饱和脂肪酸的脂类的统称,一直是热门的油脂研究领域之一。因为n-3多不饱和脂肪酸具有治疗和/或预防肿瘤、心血管、痛风、中风等生物学功能,对人体健康十分有益,尤其是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA),更被公认为人体的“黄金油”。近年来,研究者发现,十八碳四烯酸(SDA)经机体代谢后可转化为EPA或DHA,成为可取代EPA和DHA的可供选择的新资源。此外,研究还表明,SDA除具有如十八碳三烯酸(ALA)、EPA、DHA等n-3多不饱和脂肪酸所表现出相似的生物学特征,而且表现出了更多的生物学功能(如SDA是合成前列腺素E2的重要前提物质)。到目前为止,人们在自然环境中发现了三类富含SDA的生物体:鱼类、植物和微藻。其中,鱼类机体的SDA含量低;蓝蓟等植物所含SDA含量易受地域的温度、光照等因素影响较大。与前两者相比,海洋微藻如等鞭金藻具有生长速率、产油量高和SDA含量高的优点。因此,本课题以富含SDA的等鞭金藻为实验藻种,建立和构建板式光反应器培养该藻种的生长、产油、硝酸钠消耗的动力学方程,系统地分析微藻生长与产油的最佳平衡点。在此基础上,多次培养获得藻粉,提取微藻油脂分析等鞭金藻的油脂类型(三酰甘油、游离脂肪酸和极性脂)和脂肪酸位置分布,为后续开发特定功能性油脂提供依据。以富含SDA的三酰甘油藻油为底物,鳀鱼鱼油为对照组,利用绿色环保和能耗低的脂肪酶催化法制备富含SDA的单酰甘油和结构三酰甘油酯。同时,以等鞭金藻的富含n-3游离脂肪酸为供体,酶催化微绿球藻藻油制备富含SDA的人乳脂。在酶催化过程中,研究3种脂肪酶的催化特性(脂肪酸选择性和位置选择等特性),探索并试图发现特定脂肪酶的新特性和新用途,为研发功能性油脂提供理论基础和实践依据,具体研究内容如下:1.研究定量描述微藻生长和微藻生物量与油脂积累的权衡动力学关系,探讨微藻生物量和生长过程中各组分的依赖性和微藻油脂/蛋白质产物与氮限制的相互影响关系。在板式反应器(25L)中,检测不同初始硝酸钠浓度(0-100 mgL-1)对等鞭金藻的生长影响,结果发现:25 mg L-1的初始硝酸钠浓度下培养微藻可产最大油脂量为106 mgL-1;当初始硝酸钠浓度增加到100mgL-1,有利于微藻生物量、蛋白质和淀粉的积累。模型拟合结果暗示Baranyi-Roberts、Logistic和Luedeking-Piret模型可较好地拟合板式反应器中等鞭金藻生长、油脂积累和硝酸钠消耗动力学。25-75 mg L-1的初始硝酸钠浓度可获得微藻的高生物量和高油脂量的权衡动力学关系。基于微藻生长模型预测,高氮源下培养至平稳中期的微藻,再转移到缺氮和/或高光强度的条件下,可促进微藻油脂的积累。2.利用加速溶剂提取法提取等鞭金藻藻油,研究绿色环保的有机溶剂对提油性能的影响,结果表明:该方法具有高效短时、安全简便、消耗溶剂少和劳动强度低等优点,最有潜力开发应用于提取藻油的方法;90%乙醇与正己烷的体积比为3:1是加速溶剂提取法的最适合溶剂体积比,提油率可达95.24%。通过硅胶柱分离等鞭金藻藻油的三酰甘油和游离脂肪酸,利用气相色谱分析三酰甘油和游离脂肪酸的脂肪酸组成,气相色谱和薄层层析技术分析三酰甘油酯的脂肪酸位置分布,为后续研发功能性油脂和分析脂肪酶催化特性提供原料。3.以鳀鱼鱼油和三酰甘油藻油为底物,筛选适合醇解催化油脂制备富含n-3多不饱和脂肪酸的单酰甘油的脂肪酶,进一步研究在醇解反应过程中特定脂肪酶的选择性和位置选择性。研究表明:(1)脂肪酶CAL-A对SDA、二十碳四烯酸(ETA)、EPA、DPA和DHA的选择性显著高于脂肪酶Novozym 435和Lipozyme TL IM。(2)最适合脂肪酶CAL-A催化油脂制备高含量n-3多不饱和脂肪酸的单酰甘油的催化条件为:在乙醇与底物(油脂)的质量比为3:1,反应温度为35 ℃,含水量为5%-6%,酶载量为10%,反应时间为48 h。在此条件下,脂肪酶CAL-A催化生成的单酰甘油的总n-3多不饱和脂肪酸含量可达88-92%,高于现有文献所报道的结果。(3)在过量的乙醇体系中,CAL-A裂解底物的脂肪酸的先后顺序为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、n-6脂肪酸、ALA和其他n-3多不饱和脂肪酸。(4)核磁共振技术分析产物的结果表明,CAL-A表现非位置选择性。(5)建立CAL-A催化低含量n-3多不饱和脂肪酸油脂制备富含n-3多不饱和脂肪酸的单酰甘油的动力学模型。(6)液体酶可代替固定化酶应用于制备功能性油脂。4.以鳀鱼鱼油和富含SDA的的三酰甘油酯藻油为底物,研发Lipozyme TLIM的两步催化法(先醇解反应再酯化反应)催化制备中链-n-3多不饱和脂肪酸和棕榈酸-中链的结构三酰甘油酯,比较鱼油和藻油催化过程的差异性,寻找替代鱼油为底物制备结构三酰甘油酯的可供选择的途径。结果表明:1)第一步催化法(醇解反应)制备单酰甘油:(Ⅰ)LipozymeTLIM催化鱼油和藻油生成单酰甘油的最佳条件为:在室温条件下,含水量为5-9%,乙醇与底物的摩尔比为32:1,催化时间为6 h。在此条件下,单酰甘油含量可达30-33%。鱼油和藻油制备2-单酰甘油的PA、ALA、SDA、EPA、DHA 和总 n-3PUFAs 含量分别为 13.71%、1.44%、2.72%、9.35%、22.42%和39.01%;24.26%、6.92%、25.16%、1.17%、6.91%和 41.11%。藻油制备 2-单酰甘油的总PA+n-3多不饱和脂肪酸含量为65.37%,高于鱼油制备2-单酰甘油的总PA+n-3多不饱和脂肪酸含量(52.72%)。(Ⅱ)13CNMR技术分析产物单酰甘油,结果表明,单酰甘油的主要成分为2-单酰甘油,其含量约为90%。(Ⅲ)LipozymeTLIM催化鱼油和藻油过程中,该酶主要表现sn-1,3选择性的特性;对单酰甘油含量的生成,无显著差异。2)第二步催化法(单酰甘油与辛酸的酯化反应):LipozymeTLIM催化单酰甘油与辛酸制备结构三酰甘油酯的最适条件为:在正己烷溶剂体系下,催化温度为40℃,单酰甘油与辛酸的摩尔比为1:3,催化时间为24h。在此条件下,结构三酰甘油酯的最大转化率为91.84%。藻油和鱼油制备结构三酰甘油酯的总PA+n-3PUFAs 含量分别为 23.26%(ALA,2.67%;SDA,8.93%;EPA,0.28%;DHA,2.17%)和 18.06%(ALA,0.41%;SDA,0.81%;EPA,3.02%;DHA,7.55%)。3)Lipozyme TL IM改性鱼油和藻油后,结构三酰甘油酯的结晶温度和熔点温度都低于原油和单酰甘油的值,应用于食品、医药等领域提供依据。5.以3种商用脂肪酶(Novozym435、LipozymeTLIM和CAL-A)作为催化剂,以富含ALA、SDA和DHA的藻油和sn-2富含棕榈酸的藻油为底物,通过酯交换反应或酸解反应制备富含SDA脂肪酸的人乳脂,提高人乳脂的n-3多不饱和脂肪酸含量和营养价值。通过研究3种脂肪酶的催化工艺条件,分析脂肪酶的脂肪酸选择性,为研发人乳脂提供理论基础和实践依据。结果表明:1)在无水条件下,以正己烷为反应介质,CAL-A不催化微绿球藻藻油与富含SDA脂肪酸。(2)Novozym 435和LipozymeTLIM催化生成人乳脂的最适反应条件为:富含n-3多不饱和脂肪酸与微绿球藻藻油的摩尔比为3:1,反应温度为60℃,酶载量为10%,催化时间为24 h。在此条件下,Novozym 435和Lipozyme制备人乳脂的ALA、SDA和总n-3多不饱和脂肪酸含量分别为3.63%、5.45%和12.67%;7.32%、3.22%和13.91%。(3)在相同条件下,Novozym 435和Lipozyme TL IM对n-3多不饱和脂肪酸的选择性,由高到低的顺序为ALA>SDA>DHA。(4)在催化过程中,Lipozyme TLIM发生酰基转移的概率高于Novozym435。(5)通过酶催化后,提高产物人乳脂的总n-3多不饱和脂肪酸含量;同时,人乳脂的sn-2的棕榈酸含量可达60%以上。(6)分析人乳脂的结晶和熔点变化情况,为奶制品、面包、冰淇淋、医药等产品提供可供选择的人乳脂品种。