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第一部分TGF-β1调控CTGF表达参与角膜瘢痕形成的作用研究目的:研究角膜基质中转化生长因子-β1(transforming growthfactor-β1,TGF-β1)调控结缔组织生长因子(connective tissue growthfactor,CTGF)表达的作用,探讨CTGF介导TGF-β1促角膜瘢痕形成的作用和机制。材料和方法:随机选取体重200-300g雄性wistar大鼠用于建立体内角膜创伤模型。全身及局部麻醉成功后,做上下眼睑牵引线,沿睑裂方向切开中央1/2角膜全层,间断缝合伤口。模型建立后每天在裂隙灯下观察创口愈合及感染情况;并处死部分大鼠用于角膜取材进行组织学切片观察创伤愈合情况;提取大鼠角膜基质总RNA,荧光定量PCR检测创伤后大鼠角膜基质中TGF-β1、CTGF mRNA的表达变化。培养永生化人角膜基质纤维细胞(telomerase-immortatized humancornea stroma fibrohlast,THSF),以1×10~4个细胞/孔的浓度接种96孔板,部分细胞应用CTGF中和抗体封闭,分别用TGF-β1(3ng/ml)和CTGF(50ng/ml)刺激,24h后MTT法检测细胞增殖变化。将THSF细胞接种至6孔板,细胞贴壁后用无血清DMEM处理过夜,再用3ng/ml的TGF-β1刺激培养,24h后收集细胞,荧光定量PCR及Western blot分别检测CTGFmRNA和蛋白的表达;部分细胞同时加入CTGF抗体封闭,24h后检测Ⅰ型胶原α1(collagen Iα1,Col Iα1)mRNA的表达。结果:成功建立大鼠角膜穿通伤模型,未发生术后感染。在角膜创伤愈合过程中,基质纤维细胞增生,胶原合成增加,排列紊乱,愈合的创口处胶原排列紊乱,形成瘢痕组织。正常的大鼠角膜基质中有极少量CTGF mRNA表达,少量TGF-β1mRNA表达。创伤后大鼠角膜基质中有大量的TGF-β1及CTGF mRNA表达,并在创伤早期开始显著增加,伤后第3天时基本达到高峰,但TGF-β1表达下降速度比CTGF快,在创伤后2周基本达到正常水平。外源性TGF-β1及CTGF刺激THSF细胞24h后,MTT结果显示TGF-β1和CTGF均能够明显促进THSF细胞增殖;用中和抗体封闭CTGF后,TGF-β1和CTGF诱导的细胞增殖均被明显抑制;3ng/mlTGF-β1刺激THSF细胞24h后,与对照组相比,CTGF、ColⅠα1 mRNA和CTGF蛋白的表达增加,TGF-β1可诱导THSF细胞中CTGF、Col Iα1 mRNA和蛋白的表达;CTGF中和抗体封闭后TGF-β1促进的Ⅰ型胶原表达受到明显抑制。结论:TGF-β1和CTGF在角膜创伤后表达明显增加,共同参与角膜基质创伤修复、促进角膜瘢痕形成;TGF-β1通过调控CTGF发挥作用,CTGF是TGF-β1促角膜瘢痕形成的下游介质。第二部分:TGF-β1调控角膜基质中CTGF表达和瘢痕形成的信号通路研究目的:探讨MAPKs通路在TGF-β1调控CTGF表达促角膜瘢痕形成过程中的作用,寻求控制角膜瘢痕形成的靶点。材料和方法:体外培养THSF细胞,分别用ERK、P38、JNK通路阻断剂预处理后,TGF-β1刺激24h,收集细胞并检测CTGF mRNA的表达。建立体内大鼠角膜创伤模型,实验组用JNK通路阻断剂SP600125处理。模型建立前30分钟及建立后每天采用SP600125(50μM)结膜下注射,对照组用生理盐水处理。裂隙灯每天观察临床改变,组织切片HE染色观察角膜组织学改变。免疫组化检测CTGF、磷酸化JNK(phosphorylated JNK,P-JNK)变化,荧光定量PCR检测TGF-β1及CTGF mRNA的表达。培养THSF细胞,SP600125阻断JNK通路后,再用TGF-β1刺激THSF细胞,24h后MTT法检测细胞增殖情况。外源性TGF-β1刺激THSF细胞后,在不同时间点分别采用免疫荧光和Western blot技术检测P-JNK蛋白的表达。在SP600125预处理后的THSF细胞中,用TGF-β1或划伤刺激,观察各组细胞划伤的创伤修复情况;并在24h后收集各组细胞,荧光定量PCR技术检测CTGF、纤维粘连接蛋白(fibronectin,FN)和Col Iα1mRNA的表达。结果:MAPKs各通路阻断剂可不同程度的抑制TGF-β1诱导的CTGF表达,以JNK通路的作用最显著,与对照组及其它实验组相比均有统计学意义(P＜0.05)。正常的大鼠角膜基质中几乎没有P-JNK的表达,创伤后表达明显增多,SP600125能够抑制创伤后JNK通路的活化。SP600125处理后,与对照组相比,创伤诱导的大鼠角膜基质中CTGF的表达受到明显抑制,而对TGF-β1的表达没有明显影响。TGF-β1及CTGF均能促进细胞增殖;而SP600125处理后,TGF-β1促THSF细胞增殖的作用受到明显抑制。TGF-β1作用于细胞后,THSF细胞中P-JNK蛋白表达较对照组明显上调。TGF-β1刺激组细胞划伤后迁移速度明显快于对照组,而SP600125预处理后明显抑制TGF-β1促进的细胞迁移能力。TGF-β1或创伤刺激THSF细胞24h后,CTGF、FN和Col Iα1 mRNA在各组中均有表达,其中创伤和TGF-β1刺激组呈高表达,而SP600125处理组表达明显降低。结论:JNK通路参与角膜创伤愈合过程,可能介导TGF-β1上调CTGF表达和促角膜瘢痕形成的过程,深入研究明确JNK通路的作用,有望为控制角膜瘢痕的形成提供新的途径。第三部分:RNA干扰研究JNK通路介导角膜基质中TGF-β1调控CTGF表达的作用目的通过前期实验(第一、二部分)研究发现,TGF-β1能够通过上调CTGF表达促角膜瘢痕形成,JNK通路可能介导了TGF-β1诱导CTGF表达的过程,本研究通过RNA干扰技术阻断JNK通路,研究TGF-β1调控CTGF表达促角膜瘢痕形成的作用机制。材料和方法体外培养THSF细胞,针对人JNK1和JNK2基因cDNA序列设计JNK1、JNK2的特异性siRNA序列。用荧光标记的阴性对照siRNA筛选转染条件,转染试剂的浓度梯度为每350μl的体系中1-4μl。按照预实验筛选的转染条件将JNK1/2siRNA转染到无血清培养液处理过的THSF细胞中,24h后收集细胞进行抑制效应分析,荧光定量PCR检测JNK1和JNK2 mRNA的表达,以无血清DMEM及对照siRNA为对照。THSF细胞转染JNK1/2 siRNA成功后,采用TGF-β1(3ng/ml)或10μlTip枪头划伤刺激细胞,倒置显微镜下观察创伤愈合情况。刺激15min后采用免疫荧光检测P-NK1/2表达,24h后收集细胞检测CTGF mRNA和蛋白,Ⅰ型胶原蛋白的表达。结果荧光显微镜观察见不同浓度的转染条件下荧光标记siRNA的转染效率均超过90%,每350μl体系中应用2μl转染试剂时转染效率最高,细胞状态好。JNK1/2siRNA转染THSF细胞后,荧光定量PCR结果示JNK1和JNK2的mRNA表达均受到明显抑制,抑制效率均超过80%。用Tip枪头划伤刺激THSF细胞后,JNK1/2siRNA干扰组细胞与对照组相比迁移速度明显减慢。免疫荧光结果显示TGF-β1刺激后,DMEM组及阴性siRNA对照组细胞中P-JNK表达明显增多,JNK通路活化;而JNK1/2 siRNh干扰组细胞中的P-JNK表达较对照组明显减少。TGF-β1及创伤刺激均能够明显促进THSF细胞中CTGF mRNA和蛋白的表达;RNA干扰在基因水平阻断JNK通路后,上调的CTGF表达受到明显抑制。此外,阻断JNK通路也能够抑制TGF-β1诱导的Ⅰ型胶原蛋白表达。结论RNA干扰能够有效的阻断JNK通路;JNK通路介导TGF-β1调控的CTGF表达。