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NADH氧化酶广泛存在于各种生物体内,在调控细胞氧化还原及渗透压平衡以维持细胞正常生长发育方面发挥重要作用。这类酶可直接消耗溶解氧以催化氧化NADH生成NAD+,因此可应用于NAD+的再生研究。产H2O型NADH氧化酶除了具有高效催化的特点,由于其催化产物是水,无副产物生成,在工业中具有较大的应用潜力。本论文选择了两种产H2O型NADH氧化酶（FAD及FMN依赖型）,通过定点突变及分子模拟研究该酶结构与催化活力之间的关系,并且基于NADH氧化酶构建高效NAD+再生体系,用于L-塔格糖的催化合成。论文首先对来源于鼠李糖乳杆菌的产H2O型NADH氧化酶（LrNox）的表面氨基酸残基根据其所处位置以及物理化学性质的不同进行理性选择,并将所选位点利用定点突变分别突变为Cys。对所有突变体及野生型NADH氧化酶进行表达纯化及表征。酶活力测定结果显示,表面Cys突变体的催化活力高度依赖于所选氨基酸残基的极性及所带电荷,当突变极性带电荷的氨基酸残基为Cys后,突变体催化活力显著下降（K380C的比活力仅为野生型的25.7%）。当所选氨基酸残基为极性不带电荷残基或者不参与酶催化功能的Ala时,Cys突变体表现出更高的催化活力（其中T96C突变体的催化活力相较于野生型提高2.7倍）。圆二色光谱结果显示,T96C突变体未明显影响蛋白质二级结构,而分子对接发现,当LrNox表面的Thr96突变为Cys后,该位点与局部溶剂的氢键数量增加导致His11和催化位点Cys42之间距离缩短,因此T96C的催化活力提高2.76倍。第三章对FMN依赖型NADH氧化酶（LrFOR）进行克隆表达及性质表征,结果显示,在FMN浓度（15μM）、温度（30 oC）、pH值（7.5）以及在45 oC条件下该酶具有最高催化活力,且半衰期为t1/2=279 min。分子对接确定位于酶活性中心的对底物NADH及辅酶FMN结合中具有重要作用的氨基酸残基Met28、Thr29、His170、Asn173、Gly298、His319与Tyr341。定点突变结果显示,将其中Thr29替换成侧链更小的Ala可将该酶比活力提高2.7倍。Thr29进一步突变结果表明,当将Thr29突变成侧链更小的Gly或带负电荷侧链的Asp时,突变体对NADH的催化活力分别提高了3.6和3.8倍。然而,当在该位点引入侧链较大的氨基酸残基如Tyr时,突变体的催化活力下降为野生型的50%。圆二色光谱结果显示单点突变体的二级结构并未发生明显变化。但分子模拟结果表明,29位引入具有较大侧链的氨基酸残基可阻碍底物NADH与酶催化中心的结合,将Thr29突变为侧链较小的氨基酸残基将有利于NADH的进入和结合,从而提高该酶的催化活力。第四章以LrNox为研究对象,对LrNox中底物结合区域的氨基酸残基根据序列比对结果、氨基酸残基所处位置、极性以及所带电荷等理化性质进行理性选择,并且将所选位点进行突变改造,获得4个单点突变体和3个多点突变体。突变体催化活力及催化动力学参数显示,其中部分突变体的底物专一性发生明显变化,其中L179S突变体对NADPH的催化活力相较于野生型提高了47.7倍,而该突变体对NADH的催化活力保留了野生型的51%,另外,大部分突变体的最适pH也发生了一定变化。圆二色光谱结果显示,单点突变对蛋白质二级结构未产生明显影响。然而,当LrNox的179位Leu突变为Ser后,Ser的羟基与NADPH的磷酸基团形成了新的氢键,且原有氢键距离明显缩短。另外,K185也与底物NADPH同时也形成了数量更多的氢键,这些新形成的和长度缩短的氢键可增加底物与酶的亲和力,从而大幅提高该酶对NADPH的催化活力。因此,改造后的突变体L179S可进一步应用于反应中消耗的NADP+的再生研究。第五章利用来源于变异链球菌的产H2O型NADH氧化酶（SmNox）与来源于类球红细菌D的半乳糖醇脱氢酶（GatDH）耦合构建辅酶NAD+再生体系。首先对GatDH的底物选择性以及最适催化条件进行表征,发现D-半乳糖醇为该酶的最适底物,且该酶在30 oC及pH 9.0条件下具有良好的热稳定性及催化活力。随后,以D-半乳糖醇为反应底物,对催化反应条件包括SmNox与GatDH的比例、底物浓度及反应时间等进行优化。结果显示,当反应时间为12 h、SmNox与GatDH比例为2:3及D-半乳糖醇浓度为100 mM时,该反应转化率达88%(空时产率达1.33 g·L-1·h-1),且实现了NAD+高效再生（仅需添加3 mM NAD+,该系统可有效催化100 mM D-半乳糖醇的转化）。论文通过对两种产H2O型NADH氧化酶（LrNox及LrFOR）的结构分析,对酶的表面区域、活性口袋以及底物选择性区域进行多方面突变改造,获得了具有更高催化活力的突变体。最终,使用产H2O型NADH氧化酶（SmNox）与半乳糖醇脱氢酶联用构建高效辅酶NAD+再生体系,实现了高浓度L-塔格糖的高效生产。论文为NADH氧化酶结构改造奠定了基础,并且为NAD+的酶促再生研究提供了借鉴。