化疗在恶性肿瘤的综合治疗中占有非常重要的地位，而耐药性是严重影响肿瘤化疗效果的主要原因之一。叶酸是DNA合成及甲基化过程中所必须的原料。氨甲蝶呤(methotrexate，MTX)是一种叶酸拮抗剂，能竞争性地结合二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)抑制核苷酸代谢，从而阻断DNA的合成，特异性地杀伤增殖期细胞诱导凋亡。然而，在抗肿瘤治疗中，持续给药会导致细胞获得耐药性，使治疗效果不佳。为进一步探讨耐药性的形成机制，本研究以人结肠癌HT29细胞系及其MTX耐药细胞系作为研究对象，探讨DHFR相关通路基因与MTX耐药机制的相关性，旨在寻找肿瘤细胞MTX耐药性产生中发挥作用的DHFR上、下游基因，并为新型靶向性药物的开发提供依据。　　 本实验中，首先建立人结肠癌细胞系HT-29对MTX产生耐药的细胞株，运用RT-realtime PCR、western blot分别比较亲代敏感细胞与耐药敏感细胞中DHFR相关通路基因的差异表达情况。结果显示发现了在耐药细胞中MTX的靶基因DHFR发生明显的扩增及过表达，除此之外，我们发现三个在耐药细胞中高表达DHFR信号通路基因，分别为MTHFR，ATIC及AK3。运用siRNA技术在耐药及敏感细胞中将DHFR蛋白干涉，分别检测干涉前后耐药及敏感细胞中以上三个基因的表达情况，发现干涉DHFR后MTF-IFR及ATIC高表达，而AK3低表达，提示AK3是位于DHFR下游的靶基因，MTHFR及ATIC在通路中与DHFR发挥协同作用。之后，运用RNAi knockdown技术在耐药及敏感细胞中将DHFR、MTHFR、ATIC、AK3分别单独干涉，检测干涉前后细胞对MTX敏感性的变化。结果显示在耐药及敏感细胞中，干涉后细胞对MTX的耐药性得到明显改善。同时，将MTHFR、ATIC、AK3分别与DHFR的进行联合RNAi knockdown，或将所有耐药相关的靶基因进行联合干涉，检测干涉前后细胞对MTX敏感性的变化。结果显示在耐药及敏感细胞中，联合干涉多个与耐药相关的靶基因将更加明显的改善肿瘤细胞的耐药性。所有结果提示人结肠癌细胞HT29中除了靶基因的扩增及过表达参与氨甲蝶呤耐药，DHFR相关信号通路基因MTHFR、ATIC、AK3在耐药过程中同样发挥重要作用。　　 本研究的结果表明：DHFR相关信号通路基因MTHFR、ATIC、AK3参与人结肠癌细胞系HT29 MTX耐药机制的产生。MTHFR及ATIC与DHFR在参与MTX耐药性产生机制中起协同作用，而AK3是位于DHFR下游的基因。以上四个基因在肿瘤细胞对MTX产生耐药性过程中起关键作用，为新型靶向性化疗药物的开发及临床多种化疗药物的联合应用提供依据。