红霉素A作为一种重要的广谱抗生素，特别是以红霉素A为原料中间体的第二代和第三代红霉素在临床上的开发应用，其重要性愈显突出。但我国红霉素发酵生产上却一直面临着生产菌株发酵单位不高和有效组分红霉素A偏低的问题。本文试图以改善发酵液组份，提高红霉素A含量为切入点，开展代谢工程研究，通过遗传操作，调节红霉素合成后修饰途径关键基因表达，构建红霉素发酵单位明显提高、组分比例明显改善的新型工业用生产菌株。 为了对高产出发菌种进行遗传改造，首先采用原生质体转化和属间接合转移进行了尝试和优化，成功地建立了出发工业生产菌株S.erythraea HL3168与E. coli ET12567(pUZ8002)之间的属间接合转移遗传转移系统，其接合转移效率达到10-5。 为了高效地检测发酵产物中红霉素各组份的含量，通过HPLC和LC-MS方法确立了红霉素发酵产物的定量和定性检测条件。 在对红霉素生物合成过程和后修饰酶生化特性的分析基础上，首先采用强化羟基化酶(EryK)表达的策略，通过同源交换重组在出发菌株中增加一个羟基化酶的拷贝，并将其置于红霉素抗性基因启动子PermE*控制下，得到了重组菌mCYK。其生物活性测定揭示，重组菌的产量没有明显的下降，说明我们的遗传改造策略没有影响红霉素的生物合成能力，对高产出发菌HL3168是可行的；而重组菌的组份分析结果表明，杂质组份红霉素B完全消除，同时红霉素C的浓度从出发菌株中的0.26.mg/mL增大到重组菌mCYK中的0.88 mg/mL，表明后续的甲基化酶活力仍然不够，需要进一步加强。 于是同时强化羟基化酶和甲基化酶(EryG)的表达，同样通过同源交换重组在出发菌株中同时增加一个羟基化酶和一个甲基化酶的拷贝，由于重组位点的不同分别得到了两种重组菌：mCYKG-K和mCYKG—G。生物活性测定表明重组菌mCYKG—K的效价与出发菌相比，提高了19.4％；而重组菌mCYKG-G的效价与出发菌相比没有明显的差距。组份分析结果表明重组菌中红霉素C的积累明显减少，在重组菌mCYKG-K和mCYKG-G中红霉素C的浓度分别为0.08 mg/mL，0.05 mg/mL；同时有效组份红霉素A与杂质组份B和C的比例得到大幅提高，分别达到1 7.2：1和10.4：1(S. erythraea HL3168为2.9：1)。但相比重组菌mCYK，红霉素B的积累有一定程度的恢复，重组菌mCYKG—K和mCYKG-G中分别为0.15 mg/mL，0.28 mg/mL，说明采用同时强化的策略两种后修饰酶的活力仍然不匹配。 根据前面的结果，进一步强化羟基化酶的表达，并通过表达单元的设计和插入位点的改变调节羟基化酶与甲基化酶的表达强度。利用PermE*，eryK和eryG基因构建了PermE*-eryK-eryK-eryG和PermE*-eryK—eryG—eryK两种不同顺序的基因表达单元，同样通过遗传重组方式得到六种含有三个拷贝ervK基因和两个拷贝eryG基因的重组菌株：重组菌mCYKKG-KI，mCYKKG-KII，mCYKKG-G，mCYKGK-KI，mCYKGK-KII和mCYKGK-G。其生物活性测定表明，重组菌mCYKKG-KI和重组菌mCYKGK-KI的生物效价有近30％的提高；同时其组份分析结果表明两者完全去除了杂质组份红霉素B和C。这一结果表明通过增加羟基化酶和甲基化酶的表达，并调节两种后修饰酶的表达强度，能够完全去除杂质组份红霉素B和C，并且通过疏导中间产物转化为最终产物红霉素A，从而提高了红霉素的发酵单位。对重组菌进行发酵表型研究的同时，通过实时定量PCR的方法研究所操纵基因的相对转录强度。结果表明，通过在出发菌株中引入额外拷贝的eryK基因和eryG基因，能明显增加它们的相对转录强度。增加一个额外拷贝的eryK基因和eryG基因，使得它们的相对转录强度增加2-7倍，而增加二个额外拷贝的eryK基因，则使得它的相对转录强度增加8-14倍。在重组菌mCYKKG-KI和mCYKGK-KI中羟基化酶和甲基化酶表达强度的比例分别为2.5和2.9。综上结果表明，要完全消除红霉素发酵的中间代谢产物(红霉素B和C)，既要增加两种后修饰酶的表达，更重要的是协调两者的表达强度比例。 随后对获得的重组菌进行了代谢生理学特性的初步研究，在摇瓶发酵过程中糖、氮、磷等常规代谢参数上，并没有发现重组菌和出发菌有显著差异。另外从蛋白组水平对部分重组菌和出发菌株进行了初步比较，发现在同样条件下蛋白表达存在一定的差异。