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油酰磷脂酰胆碱去饱和酶(FAD2)是一种重要的植物脂肪酸去饱和酶,位于内质网中,催化油酸生成亚油酸。亚油酸等多不饱和脂肪酸含量过高的植物油脂不稳定,易氧化,不易贮藏,而且氧化产物对人体有害。因此油脂改良的一个重要目的是提高种子油脂的油酸含量,降低多不饱和脂肪酸含量。另外,关于FAD2的结构、功能和表达调控等问题目前还不清楚,有待深入研究。近年发展起来的RNAi技术可有效地沉默目标基因,研究植物FAD2基因沉默后膜脂和油脂的变化及温度对基因沉默的影响,有助于深入理解FAD2酶的功能、表达调控方式和有效地利用基因沉默技术改变膜脂组成、提高植物油脂品质。本研究的主要目的是,首先采用RNAi技术抑制烟草FAD2基因(NtFAD2)的表达以降低NtFAD2酶活性,得到膜脂不饱和度改变的烟草转基因株系。然后研究NtFAD2基因沉默后脂肪酸去饱和过程的变化及其机理,以及温度对NtFAD2基因沉默的影响。研究中首先用PCR方法克隆烟草NtFAD2基因,用其编码区的一个片段构建表达发卡RNA的沉默结构,用农杆菌介导的方法转化烟草,从第一代转基因植株中筛选出油酸含量高的突变体。然后对其中一个转基因株系S61进行脂肪酸分析,发现叶片总脂和质体外单脂PC和PE中的油酸含量大幅度增加。此外,NtFAD2基因沉默对叶片甘油脂的影响有多效性,即质体内的单脂油酸含量也有显著增加,有些单脂中软脂酸含量有所下降。烟草NtFAD2基因沉默后,在叶片和种子中油酸含量变化最大,说明NtFAD2基因在不同器官中的沉默效果不同:沉默结构对NtFAD2酶活性较高的器官抑制程度更大,内源基因没有表现均一的沉默效果。沉默植株的多种组织中NtFAD2基因的mRNA降解程度相似,说明油酸含量与NtFAD2转录本的丰度没有直接关系。植物脂肪酸的不饱和程度受温度调控,因此研究FAD2基因沉默株系的油酸含量受温度影响情况及其调控规律对RNAi技术在油脂改良方面的实际应用具有十分重要的意义。研究结果表明,随着生长温度的下降,野生烟草叶片膜脂油酸含量降低,多不饱和脂肪酸含量随之增加; 转基因烟草中油酸和多不饱和脂肪酸有相似的变化趋势,但是变化幅度远远大于野生烟草。低温下转基因烟草叶片油酸含量之所以大幅度下降,其中一个重要原因是被抑制的NtFAD2酶受低温的调节而活性升高。然而研究发现,与常温条件下相比,低温下转基因烟草NtFAD2基因的mRNA丰度不变,说