论文部分内容阅读
野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)是十字花科植物重要的病原菌，能引起十字花科作物发生黑腐病，造成巨大经济损失，同时它所产生的胞外多糖(EPS)又称黄原胶，在工业上具有广泛用途。由于具有巨大的经济价值，目前人们已对其致病机理和EPS合成机理作了较多的研究。本课题组主持完成了对Xcc 8004菌株的全基因组序列的测定，并构建了8004菌株的Tn5gusA5突变体库。本工作在这基础上，对17280株8004的Tn5gusA5突变体进行致病性试验，筛选到226株致病缺陷突变体，采用TAIL-PCR克隆部分突变体的插入失活基因，并对插入失活基因进行缺失和互补分析，鉴定和克隆了4个致病相关基因。 5株wbxL基因的不同插入位点的Tn5gusA5突变体剪叶接种时丧失致病力，对wbzL基因进行缺失和互补分析，wbxL基因缺失突变体致病性严重降低，突变体在寄主体内的生长繁殖受到抑制，但EPS的合成和胞外酶活性不受影响，一段体外合成的包含wbxL基因的DNA片段能反式互补该突变体，恢复突变体的致病性；对wbxL基因的序列分析表明，该基因与P. aeruginosa编码糖基转移酶的wbpL具有45％相似性，并且该基因演绎的氨基酸序列具有第4家族的糖基转移酶功能域。 对waxE基因进行缺失和互补分析，waxE基因缺失突变体的致病性和EPS的产量均降低，与野生型菌株8004相比，EPS的产量降低35％，但其胞外酶活性不受影响，突变体在寄主体内的生长繁殖受到抑制，一段体外合成的包含waxE基因的DNA片段能反式互补该突变体，恢复突变体的致病性和EPS产量；对waxE基因的序列分析表明，该基因与S. marcescens的kdtX基因和K. pneumoniae的waaE基因分别具有52％和50％的相似性，并且其演绎的氨基酸序列具有第2家族糖基转移酶的功能域。 对wxcA基因进行缺失和互补分析，wxcA基因缺失突变体的致病性严重降低，突变体在寄主体内的生长繁殖受到抑制，其LPS和EPS的合成均受影响，EPS产量与8004相比，降低50％左右，但其胞外酶活性不受影响，一段体外合成的包含wxcA基因的DNA片段能反式互补该突变体，恢复突变体的致病性和LPS、EPS的合成；对wxcA基因的序列分析发现该基因与C. crescentus的可能编码糖基转移酶的IpsE基因具有44％的相似性，wxcA基因演绎的氨基酸序列具有第1家族糖基转移酶的功能域。 4株ppsA基因的不同插入位点的Tn5gusA5突变体剪叶接种时丧失致病力，对ppsA基因进行缺失和互补分析，ppsA基因缺失突变体的致病性严重降低，突变体在寄主体内的生长繁殖受严重抑制，但EPS的合成和胞外酶活性不受影响，一段体外合成的包含ppsA基因的DNA片段能反式互补该突变体，恢复突变体的致病性。