阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）与二型糖尿病（typeⅡdiabetes mellitus,DM2）是两种常见的年龄相关性疾病。二者具有相似的流行病学及生物化学特征,且均与蛋白质聚集,最终形成纤维状结构有关——胰岛淀粉样多肽（Amylin）聚集于DM2的胰腺组织,β淀粉样蛋白（Aβ）聚集于AD的脑组织。大量研究表明,两种疾病具有明显的相关性。Amylin寡聚体在脑内的出现被认为是导致AD发生发展的新危险因素。虽然Amylin已被证实,其聚集过程可改变内钙([Ca²⁺]_i)稳态,进而损伤胰岛β细胞,但其神经毒性机制仍不清楚。本文中,我们应用离子成像、全细胞膜片钳及免疫荧光等技术,探究Amylin对大鼠海马神经元的损伤机制。大量报道指出,Aβ蛋白在细胞膜表面形成寡聚体的过程中,可以产生大量的ROS,从而破坏细胞膜的稳定性。我们猜想高浓度hAmylin对神经元的损伤机制可能与之相似。因此,我们借助免疫荧光、活细胞工作站及扫描电镜,进一步探究hAmylin对神经元细胞膜稳定性的影响。第一部分胰岛淀粉样多肽对大鼠海马神经元内钙的影响目的:分析不同来源、不同浓度的Amylin对原代大鼠胎鼠海马神经元[Ca²⁺]_i的影响及其机制。方法:培养原代大鼠胎鼠海马神经元,应用免疫荧光技术鉴定神经元纯度,及相关受体表达。利用钙成像技术记录神经元[Ca²⁺]_i变化。利用免疫荧光观察Amylin受体的表达量。利用透射电镜观察Amylin的聚集状态。结果:1原代海马神经元纯度鉴定神经元细胞纯度>98%2 Amylin对原代海马神经元[Ca²⁺]_i的影响应用不同浓度的hAmylin对原代大鼠海马神经元进行干预,发现1-30μM的hAmylin可诱导神经元[Ca²⁺]_i显著增加（P<0.05）。神经元对3μM和10μM hAmylin的反应率分别为38.46%和55.05%。10μM hAmylin可使R（340/380）增长67.6±17.5%,EC50约等于2.53μM。海马神经元[Ca²⁺]_i在给予10μM hAmylin约10 s后达峰,且可维持在峰值,无衰减。在撤药洗脱后约30 s,[Ca²⁺]_i可恢复至基线。重复给药[Ca²⁺]_i增加的峰值未见明显变化（P>0.05）,说明没有药物脱敏现象。大约10%的神经元在给予10μM鼠来源的Amylin（r Amylin）及普兰林泰（hAmylin类似物,不发生聚集）后,产生[Ca²⁺]_i增加现象。R（340/380）增长分别为22.1±4.0%和24.8±7.0%,与应用10μM hAmylin相比,反应显著降低（P<0.001）。10μM Amylin受体抑制剂AC187或AC253本身并不影响神经元[Ca²⁺]_i,但可阻断1μM hAmylin、10μM普兰林泰及10μM r Amylin的作用,而10μM hAmylin所导致的[Ca²⁺]_i增加现象不受影响。说明低浓度（1μM）hAmylin、10μM普兰林泰及10μM r Amylin所引起的[Ca²⁺]_i增加现象是一种受体依赖的机制,而高浓度（10μM）hAmylin所引起的内钙增加现象是一种非受体依赖的机制。3 Amylin受体RAMP在胎鼠海马神经元及成年大鼠脑片海马区的表达应用免疫荧光技术,我们发现Amylin受体RAMP1、2亚型在胎鼠海马神经元及大鼠脑片海马区均有高表达。RAMP3亚型仅在胎鼠海马神经元高表达,而成年大鼠脑片海马区表达量较低。4浓度对hAmylin聚集的影响我们推测高浓度（10μM）hAmylin所诱导的[Ca²⁺]_i增加与hAmylin的聚集有关。因此,我们应用透射电镜对hAmylin的聚集状态进行观察。高浓度hAmylin（10μM）在37℃孵育1 h和24 h后,分别观察到寡聚体及纤维状结构的产生。而在低浓度hAmylin（1μM）溶液中并未观察到类似结构。说明hAmylin诱导[Ca²⁺]_i增加的非受体依赖机制,可能与其在高浓度下更容易出现错误折叠,产生寡聚体及纤维状结构的特性有关。第二部分人胰岛淀粉样多肽对TRPV4的兴奋性调节作用目的:探究高浓度hAmylin诱导神经元[Ca²⁺]_i增加的非受体依赖机制方法:培养原代大鼠胎鼠海马神经元,利用钙成像技术记录神经元[Ca²⁺]_i变化,利用全细胞膜片钳技术记录细胞静息电位。利用scRT-PCR,及siRNA技术探究TRPV4在hAmylin诱导[Ca²⁺]_i增加反应中的作用。结果:1神经细胞膜钙通透性离子通道与hAmylin诱导的[Ca²⁺]_i增加细胞[Ca²⁺]_i增加的来源只能是胞外钙内流或（和）胞内钙库释放。为探究hAmylin所诱导的[Ca²⁺]_i增加是否来源于外钙。我们使用了无钙细胞外液,并加入0.1 m M EGTA鳌合残存的外钙。在无钙外液中,10μM hAmylin诱导[Ca²⁺]_i增加的现象消失。说明细胞膜上的钙离子通道在hAmylin诱导[Ca²⁺]_i增加的现象中扮演重要角色。为进一步排除胞内钙库释放对该现象的影响,我们给予5μM环匹阿尼酸（cyclopiazonic acid,CPA）内质网钙ATP酶抑制剂,孵育1 min后,引起神经元[Ca²⁺]_i增加。随后,再次给予hAmylin仍可引起神经元[Ca²⁺]_i的快速增加,且增加程度与不应用CPA相比无明显变化（P>0.05）。用1μM毒胡萝卜素（thapsigargin,TG）替代CPA,重复该实验得到相同结果。说明增加的[Ca²⁺]_i主要来源于胞外钙内流,而非胞内钙库释放。2电压门控性钙离子通道与hAmylin诱导的神经细胞[Ca²⁺]_i增加我们利用膜片钳技术检测hAmylin对神经细胞膜静息电位的影响。我们发现在给予hAmylin后,细胞膜静息电位由-55.67±2.35m V上升至-35.00±2.80 m V。个别细胞还观察到动作电位的产生。考虑到细胞膜静息电位去极化至-40 m V时,即可激活L型钙通道。因此我们认为hAmylin诱导[Ca²⁺]_i增加的现象有电压门控性钙离子通道参与。我们给予L型钙通道阻断剂氨氯地平（5μM）或N型钙通道阻断剂芋螺霉素（1μM）孵育1 min后,hAmylin诱导的R（340/380）增加率分别为44.49±13.84%和52.84±13.23%,与单独应用hAmylin（67.98±14.85%）相比,有明显差异（P<0.01）。说明电压门控性钙离子通道参与了hAmylin诱导神经元[Ca²⁺]_i增加。然而,即便在同时给予氨氯地平和芋螺霉素时,仍不能完全抑制hAmylin的作用,提示仍有其他的钙通透性通道参与该反应。3 hAmylin诱导的神经细胞[Ca²⁺]_i增加依赖于外钠参与为探究hAmylin导致神经细胞膜去极化的机制,我们用NMDG（一种不透过阳离子通道的大体积有机阳离子）代替了细胞外液中的Na+。在无钠外液中,hAmylin诱导[Ca²⁺]_i增加的现象被显著抑制。反应阳性率降至18.2%,反应强度由65.39±15.91%降至34.34±4.57%（P<0.001）。说明hAmylin诱导[Ca²⁺]_i增加依赖于外钠内流,进而使细胞膜去极化,膜静息电位抬高。有趣的是,当我们在正常外液中加入TTX（1μM）后,hAmylin诱导[Ca²⁺]_i增加的现象无明显变化（P>0.05）,说明电压门控性钠离子通道并不参与该反应。甚至在无钠外液中加入氨氯地平,仍然无法完全阻断hAmylin诱导的[Ca²⁺]_i增加现象。因此我们考虑,可能有非选择性阳离子通道（如TRP家族）于上游进行调控。4 TRPV4参与hAmylin诱导的神经细胞[Ca²⁺]_i增加我们在给予TRP通道广谱抑制剂RR（10μM）后,hAmylin诱导海马神经元[Ca²⁺]_i增加的现象被显著抑制（P<0.01）。静息电位抬高了8.8±1.1 m V,与单独应用hAmylin（21.4±1.7 m V）相比,有显著差异（P<0.001）。为进一步探究参与反应的是TRP家族中的哪一种亚型,我们应用单细胞RT-PCR技术检测hAmylin反应阳性的海马神经元。发现6/7的阳性海马神经元表达TRPV4亚型,这与胰岛β细胞的结果一致。之后,我们使用TRPV4通道的选择性抑制剂HC067047（1μM）进行干预,发现hAmylin诱导神经元[Ca²⁺]_i增加的现象被显著抑制（P<0.01）。静息电位抬高7.4±1.1 m V,与单独应用hAmylin（21.4±1.7 m V）相比,有显著差异（P<0.001）。在成年SD大鼠的脑切片中,TRPV4在海马区的表达很低,这与之前报道相一致。然而,在原代培养的SD大鼠胎鼠海马神经元中,TRPV4在部分神经元中表达,阳性率为54%,这与钙成像hAmylin反应阳性率相一致。为进一步确证TRPV4参与hAmylin诱导的[Ca²⁺]_i增加,我们应用TRPV4通道激动剂（GSK1016790A,100 n M）对海马神经元进行干预。我们发现GSK1016790A与hAmylin诱导细胞[Ca²⁺]_i增加的现象总是相伴出现在同一神经细胞。hAmylin的反应低于GSK1016790A。我们利用siRNA技术将TRPV4通道敲低后,GSK1016790A及hAmylin诱导的[Ca²⁺]_i增加较未敲低组显著降低（P<0.05）。说明TRPV4通道是hAmylin诱导神经元[Ca²⁺]_i增加上游反应的关键靶点,这一结果与胰岛β细胞的研究一致。为探究hAmylin是否可以直接激活TRPV4通道,我们对转染TRPV4通道的HEK293细胞,直接给予GSK1016790A（100 n M）与hAmylin。发现GSK1016790A诱导[Ca²⁺]_i增加的反应仍然存在,而hAmylin诱导[Ca²⁺]_i增加的反应消失。说明hAmylin并非直接激活TRPV4通道,或其需要某些因素共同参与时才可激活该通道。第三部分人胰岛淀粉样多肽对细胞膜稳定性的影响目的:探究hAmylin激活TRPV4的机制方法:培养原代大鼠胎鼠海马神经元,应用离子成像技术记录神经元[Ca²⁺]_i变化,线粒体膜电位的变化及ROS的生成。利用免疫荧光、活细胞工作站、扫描电镜观察hAmylin对细胞膜稳定性的影响。结果:1 hAmylin聚集状态的观察我们将N端标记FAM荧光的hAmylin加入细胞培养基中,37℃孵育15 min后,更换培养基,可观察到聚合的hAmylin荧光。用新鲜培养基进一步摇床洗脱之后,荧光消失。说明hAmylin更容易在细胞表面发生聚集,而没有进入细胞内发挥作用。为分析hAmylin的聚合过程是否可逆,我们在更换培养基后,持续观察聚合的hAmylin荧光12 h,荧光并未减少。说明hAmylin聚合的过程是不可逆的。2 hAmylin长时间作用对神经元形态的影响我们利用活细胞工作站,对高浓度（10μM）hAmylin作用下的神经元形态进行长时间观察。10μM hAmylin作用约4 h后,神经元开始出现核固缩;约9 h后,可观察到细胞凋亡。3 hAmylin对海马组织的直接影响为了观察hAmylin对海马组织的直接影响,我们给成年大鼠侧脑室注射5μL的10μM hAmylin,并于24 h后处死取脑,行冰冻切片。利用免疫荧光染色技术,我们观察到hAmylin导致的海马区神经元缺失。在我们的实验中,并未观察到明显的小胶质细胞浸润,说明炎症反应并非造成神经元缺失的主要原因。4 hAmylin对细胞膜完整性的影响我们猜想hAmylin诱导神经元[Ca²⁺]_i增加可能与其寡聚体能在细胞膜表面形成非选择性离子通透性孔道有关。我们对HEK293细胞给予10μM hAmylin 1 min,并未观察到细胞[Ca²⁺]_i的变化。在全细胞电压钳下也同样未观察到hAmylin引起电流变化。利用免疫荧光技术,对神经元及神经胶质分别进行特异性抗体染色。用hAmylin替代打孔剂Triton X-100后发现。神经元经短时间（1 min）hAmylin孵育后,镜下即可观察到免疫荧光。而胶质细胞短时间（1 min）hAmylin孵育后,并未观察到免疫荧光。若孵育时间延长至30 min,则神经元、胶质细胞于镜下均可观察到相应免疫荧光。说明hAmylin在细胞表面聚合过程中,确实可以导致细胞膜完整性的破坏,使一抗进入细胞内。但不同种类的细胞膜,所需孵育时间不同。这可能是导致hAmylin在短时间内,无法增加HEK293细胞[Ca²⁺]_i的原因。为进一步确证hAmylin对细胞膜稳定性的影响,我们利用扫描电镜对细胞进行观察。发现经hAmylin孵育后,神经元及胶质细胞膜完整性遭到破坏。对HEK293细胞转染LifeAct质粒,标记细胞骨架（F-actin）后,在活细胞工作站中,观察hAmylin长时间作用。结果显示,10μM hAmylin的长时间作用同样可对HEK293细胞的细胞骨架造成损伤。5 hAmylin对神经元ROS生成及线粒体膜电位的影响有报道指出,Aβ蛋白破坏细胞膜完整性的机制主要与其在细胞表面聚合时生成ROS有关。我们猜想hAmylin破坏细胞膜完整性的机制可能与此相同。我们利用离子成像技术,对神经元ROS的生成进行观察。发现高浓度（10μM）hAmylin可以明显增加神经元ROS的生成（P<0.001）,而低浓度（1μM）hAmylin无此作用。说明ROS的生成主要与hAmylin的聚合有关。我们利用JC-1染料,进一步观察hAmylin对神经元线粒体膜电位的影响。发现高浓度（10μM）hAmylin可以明显降低线粒体膜电位,而低浓度（1μM）hAmylin无此作用。当给予线粒体PTP开放抑制剂Cs A（1μM）后,高浓度（10μM）hAmylin所导致的线粒体膜电位降低现象被显著抑制（P<0.001）,但不能抑制它所导致的[Ca²⁺]_i增加及ROS的生成。说明hAmylin诱发的[Ca²⁺]_i增加以及ROS生成还有其他机制。结论:hAmylin通过受体依赖及非受体依赖两种机制诱导大鼠海马神经元[Ca²⁺]_i增加;低浓度hAmylin主要通过受体依赖机制,而高浓度hAmylin主要通过非受体依赖机制增加神经元[Ca²⁺]_i。hAmylin在高浓度时容易发生错误折叠,形成寡聚体作用于神经元表面,激活TRPV4通道诱发细胞膜去极化,进而激活电压门控性钙通道,导致神经元[Ca²⁺]_i进一步增加。随着hAmylin寡聚体在神经细胞表面聚集时间延长,细胞膜完整性受损、ROS生成增加以及线粒体膜电位下降,最终导致神经细胞凋亡。