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目的: 原核表达GPC1重组蛋白,制备抗GPC1多克隆抗体及单克隆抗体,并应用于时间分辨荧光免疫分析.人磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)是胰腺癌早期较为灵敏、特异的生物标志物,本研究为检测早期胰腺癌标志物GPC1初步奠定了基础. 方法: 1人磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)的原核表达、纯化及抗原性鉴定 扩增GPC1 N端(70~1422bp),将其与pET-28a载体进行无缝克隆连接;将测序鉴定正确的pET28a-GPC1重组质粒转化入Rosetta感受态细胞中,诱导表达,纯化并复性;通过蛋白质免疫印迹技术对复性后的GPC1重组蛋白进行抗原性鉴定. 2人磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)多克隆抗体的制备及鉴定 制备免疫原,进行四次皮下多点注射,免疫新西兰兔,免疫结束后进行ELISA效价测定,效价达到预期值后进行心脏采血;多抗血清分别经过饱和硫酸铵沉淀, G-25柱脱盐,DEAE柱及Protein G柱纯化,最后通过蛋白质免疫印迹技术鉴定. 3人磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)单克隆抗体的制备及鉴定 制备免疫原,进行三次皮下注射,免疫BALB/c小鼠,免疫结束后进行ELISA效价测定,效价达到预期值后取脾进行细胞融合;经过杂交瘤细胞筛选及亚克隆化,筛选出阳性株后通过小鼠腹水法大量制备单克隆抗体;腹水分别经过饱和硫酸铵沉淀,G-25柱脱盐,DEAE柱及Protein A柱纯化,最后通过蛋白质免疫印迹技术鉴定. 4时间分辨荧光免疫分析检测GPC1方法的初步建立 对检测抗体进行生物素标记,对链霉亲和素(SA)进行Eu3+标记;从抗体配对选择、捕获抗体浓度、检测抗体稀释比例、EU3+-SA稀释比例及孵育时间等方面进行最佳工作条件优化,初步建立TRFIA检测GPC1的方法;对建立的方法进行初步评价,包括标准曲线的建立、线性范围、检测限、敏感性、特异性及精密度等;最后,通过临床样本初步验证该方法. 结果: 1.人磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)的原核表达、纯化及抗原性鉴定 成功制备出分子量约为54kD的GPC1重组蛋白,经过SDS-PAGE鉴定,目的蛋白的表达形式主要为包涵体,表达量约占包涵体总蛋白的70%左右.包涵体裂解液经镍柱亲和层析纯化后,纯度可达90%以上.复性后的GPC1蛋白经蛋白质免疫印迹鉴定,可与商品化抗GPC1单克隆抗体特异性结合. 2.人磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)多克隆抗体的制备及鉴定 成功免疫新西兰兔,兔抗血清经纯化后,纯度达90%以上,抗体效价为1∶524288.纯化后的抗GPC1多克隆抗体经蛋白质免疫印迹鉴定,可与GPC1重组蛋白及胰腺癌PANC-1细胞中的GPC1蛋白特异性结合. 3.人磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)单克隆抗体的制备及鉴定 成功融合小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0,融合率为81.9%.经两次亚克隆筛选后,得到4株稳定分泌GPC1单克隆抗体的杂交瘤细胞株A6-6、A6-8、A6-12、A6-14,染色体数目分析正确.小鼠腹水效价为1∶2097152,纯化后纯度可达90%以上,抗体效价为1∶524288.纯化后的抗GPC1单克隆抗体经蛋白质免疫印迹鉴定,可与GPC1重组蛋白及胰腺癌PANC-1细胞中的GPC1蛋白特异性结合. 4.时间分辨荧光免疫分析检测GPC1方法的初步建立 最佳工作条件优化结果: ①抗GPC1多克隆抗体捕获,抗GPC1单克隆抗体A6-6检测; ②捕获抗体最佳浓度为3μg/ml,检测抗体最佳稀释比例为1∶100, Eu3+-SA最佳稀释比例为1∶400; ③样品反应时间为120min,检测抗体反应时间为45min,Eu3+-SA反应时间为15min,解离时间为5min. 初步评价结果:标准曲线线性范围为0.4~500μg/L,R2为0.996,最低检测限为0.75μg/L.批内精密度为5.53%~8.87%,批间精密度为7.33%~12.28%,与THBS2、CA19-9和CA125均无交叉反应.该方法在胰腺癌细胞裂解液及胰腺癌血清外泌体重悬液中得到初步验证.初步建立的ROC曲线显示,当该方法的敏感性为100%,特异性为75%时,其Cut off值为20.16μg/L. 结论: 本实验成功制备了GPC1重组蛋白、抗GPC1多克隆抗体及抗GPC1单克隆抗体,初步建立了TRFIA检测GPC1的方法,并在胰腺癌细胞裂解液及胰腺癌血清外泌体重悬液方面初步验证,为检测早期胰腺癌标志物GPC1奠定了基础.