论文部分内容阅读
2010年秋季，南京市共收治食用克氏原螯虾（Procambarusclarkii，crayfish）致横纹肌溶解的病例23人，国内学者推测该疾病可能与过敏反应或生物毒素有关，但尚未得到确认。此外，虾类过敏是人类常见的一种过敏性疾病，但目前国内关于克氏原螯虾过敏原的报道仅见其分子生物学的相关研究。因此，开展关于克氏原螯虾致横纹肌溶解危害物与过敏原的分析研究具有重要的现实意义。虾类过敏严重地影响着消费者的健康，本研究拟纯化克氏原螯虾的过敏原并分析其过敏性。本研究采用甲壳类过敏患者血清的Western-blotting确定克氏原螯虾的主要过敏原，通过盐析、等电点沉淀及热处理等方法纯化过敏原并加以鉴定；通过DNAman软件分析过敏原的序列同源性，PeptideCutter软件预测其酶切位点；完成过敏原的体外模拟胃、肠液消化，以及不同时间蒸煮处理虾肉粗提液的模拟胃肠液二相消化，利用Western-blotting和抑制性ELISA分析其消化稳定性及免疫活性。结果显示，克氏原螯虾中相对分子量36kDa的蛋白组分与13份甲壳类动物过敏患者血清均发生特异的免疫杂交反应，与兔抗拟穴青蟹原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）多克隆抗体发生特异性免疫杂交反应，且该蛋白耐热，等电点约4.5，表明克氏原螯虾的主要过敏原为TM；克氏原螯虾TM与南美白对虾TM、拟穴青蟹TM的氨基酸序列相似性较高（＞90%），有49个胰蛋白酶和6个胰凝乳蛋白酶的酶切位点（酶切几率＞70%）；TM不易被胃蛋白酶降解，易于被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶降解，但消化产物仍具有一定的免疫活性；蒸煮处理可减弱TM的消化稳定性及消化产物免疫活性，且蒸煮处理时间越长，效果越显著。以上结果表明TM为克氏原螯虾主要过敏原，与其他甲壳类动物TM序列相似性较高，模拟胃肠液消化产物仍具有一定的免疫活性，蒸煮处理能减弱其消化稳定性及免疫活性，但不能完全消除其免疫活性。克氏原螯虾致横纹肌溶解严重地威胁着消费者的健康，但其病因至今仍未得到确认。本研究首先采用克氏原螯虾的肌肉、鳃肠腺体（Gills，Intestines，andGlands，GIG）分别与小鼠的肌浆、肌原纤维在体外孵育；其次，用捣碎的克氏原螯虾的肌肉、GIG灌胃ICR小鼠，观察小鼠的症状，收集小鼠血清用于临床化学分析，摘取小鼠组织用于病理学分析；最后，采用溶血实验和细胞毒性实验分析克氏原螯虾肌肉、GIG的甲醇/水粗提物。结果显示只有GIG盐溶性、脂溶性粗提物可降解小鼠肌原纤维；GIG灌胃处理能使小鼠出现肌无力，血清（肌酸激酶及乳酸脱氢酶等）和尿液的检测指标升高，心脏肌肉、胃、脾、骨骼肌等组织出现病变，其中三只小鼠患横纹肌溶解症，表现为：瘫痪、血清肌酸激酶水平是对照组的五倍或五倍以上、肾脏和骨骼肌出现病变，说明GIG含有致横纹肌溶解的危害物；小鼠的血清IgE水平较低，说明小鼠无发生过敏反应；GIG的甲醇/水粗提物有溶血作用和细胞毒性作用，但其作用不能被哇巴因抑制，说明克氏原螯虾不含有海葵毒素。以上结果表明克氏原螯虾GIG最有可能会诱发横纹肌溶解，且具有个体差异性，与海葵毒素和过敏反应均无关。