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包虫病(Hydattidosis)亦称囊性棘球蚴病(Cystic Echinococcosis CE)是由细粒棘球绦虫(Echinociccinae granulosus)的幼期细粒棘球蚴寄生于人或动物体内所引起的一种重要的人畜共患病,严重危害我国西部地区农牧民的身体健康。目前常用的血清学诊断抗原是棘球蚴囊液,由于其成分复杂,与其他蠕虫病患者血清有交叉反应和非特异性反应,因此假阳性问题难以克服,诊断特异性不理想。为快速和准确地诊断细粒棘球蚴病,各国研究者一直在寻找强特异性抗原和快速检验方法。斑点免疫金渗滤法(Dot Immunogold Filtration Assay, DIGFA)具有操作简便、结果稳定的特点,是目前血清学检验中较为灵敏和快速的方法。抗原B (AgB)被公认为是细粒棘球蚴特异性囊液抗原,占包囊液中主要抗原的90%,并且含量稳定。目前已经发现了5个抗原B 8 KDa亚单位,其中EgAgB8/2被公认为是目前最具诊断价值的特异性抗原。因此,克隆细粒棘球蚴AgB8/2基因cDNA并进行原核表达,获得纯化抗原,将AgB8/2抗原的特异性和斑点免疫金渗虑法的快速特点相结合研制出特异性快速诊断试剂盒,对于囊型包虫病诊断具有重要意义。利用PCR技术扩增细粒棘球蚴AgB8/2基因cDNA片段,连接到载体pET44a(+)中构建重组质粒PET-AgB8/2,克隆测序。扩增的AgB8/2基因cDNA片段全长335 bp,包含了273bp的完整开放阅读框(ORF)和起始密码子ATG前的33bp及终止密码子TAA后的29bp。序列比对显示克隆到的AgB8/2 cDNA序列与GenBank中的参考序列U15001(乌拉圭羊源)完全一致,并且与表达载体正确连接。开放阅读框(ORF)编码一个由90个氨基酸残基组成的蛋白质。重组原核表达载体pET-AgB8/2在E. coli中诱导表达,得到预期大小的目的蛋白,优化后的最佳表达条件为：当菌液OD600值为0.6时,加入终浓度为0.05mmol/L的IPTG,37℃,振荡培养5h。在优化的表达条件下获得了可溶性融合蛋白的高表达,AgB8/2融合蛋白的表达量占BL21菌体总蛋白的26%以上。纯化的融合蛋白经SDS-PAGE检测,杂蛋白基本去除。纯化的AgB8/2融合蛋白带有2个6×His标签,以Anti-His单克隆抗体Western Blot检测表明Anti-His抗体与融合蛋白特异性结合。用包虫病患者手术前血清和健康人血清分别作为一抗,Western Blot检测表明AgB8/2融合蛋白可特异性识别包虫病患者血清,而不能识别健康人人血清。表明细粒棘球蚴AgB8/2蛋白被正确表达。以纯化的AgB8/2融合蛋白为抗原,采用Dot blot方法检测了1份确诊包虫病患者血清和20份健康人血清,结果纯化的重组抗原可以特异性识别包虫病人血清,健康人血清检测假阳性率为10%。对照组全部呈阴性。表明重组融合表达的AgB8/2具有免疫学活性,可作为特异性抗原用于血清学检测。根据DIGFA法检测原理,以纯化的AgB8/2融合蛋白为预包被抗原,以预包被反应盒、硝酸纤维素(NC)膜、TBS、封闭液、显色剂稀释液、显色剂(胶体金标记SPA)、阳性对照和阴性对照组成包虫病快速检测试剂盒,检测了4份确诊包虫病人血清和30份健康人血清,结果确诊包虫病人血清识别率为100%,健康人血清假阳性率为3.33%。整个检测过程只需滴加待检血清便可在几分钟内得到检测结果。包虫病快速检测试剂盒的研制结合了AgB8/2抗原的特异性和斑点免疫金渗虑法的快速特点,将在临床诊断囊型包虫病和流行病学调查中具有广泛的应用前景,但其诊断特异性和敏感性尚需更多的确诊病人血清验证,使其进一步完善。