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本研究通过应用一系列的分子生物学软件进行分析,从已建立的Schizochytriumsp.FU-512的cDNA文库中筛选出两个基因,这两个基因分别为酰基载体蛋白基因(ACP)和丙二酸单酰转移酶基因(MAT),对它们进行了克隆并实现了ACP基因在大肠杆菌中的表达,为深入研究Schizochytrium sp.FJU-512的DHA分子合成机理奠定了基础,主要研究内容及成果如下:
(1)利用Blast将GenBank中的已发表的ACP基因与拼接后的cDNA文库序列进行比对寻找ACP同源基因,得到429 bp的全长ORF:利用Expasy工具包分析目标蛋白的理化表征,预测其肽链具有142个氨基酸,等电点为5.04。利用PredictProtein工具包,在Swiss-Prot中搜索相似序列,用MaxHom算法构建多序列比对的特征简图,在数据库中搜索相似的特征简图,利用PHD程序分析ACP蛋白二级结构,结果表明,该蛋白具有4个a-螺旋、1个较明显的环,没有β-折叠,该肽链具备多种来源的ACP蛋白的保守区域--磷酸泛酰巯基乙胺的结合位点,进化树分析表明与球等鞭金藻的进化距离最近。
(2)为了验证所克隆到的ACP序列的功能,构建重组表达载体,以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主进行表达分析。表达菌株经1%IPTG诱导培养,实现了Schizochytrium sp.FJU-512酰基载体蛋白(ACP)的表达。经SDS-PAGE分析结果表明,重组大肠杆菌表达了26 kD左右的重组蛋白。
(3)通过LA-PCR方法,从裂殖壶菌Schizochytrium sp.FJU-512基因组DNA中扩增得到约1200 bp的丙二酸单酰转移酶基因(MAT)的基因组DNA序列。然后,根据该DNA序列,设计特异性引物,提取总RNA,RT-PCR得到该基因cDNA序列。序列分析表明,该序列具备该类酶氨基酸序列的两个保守区。