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铁调素（hepcidin）由肝细胞分泌的25个氨基酸抗菌肽组成，是维持机体铁稳态的一种关键性―核心负性调节因子‖，在铁转移通路中发挥着主要作用。当机体hepcidin受抑制时，肠道铁吸收及巨噬细胞铁释放增加，使更多的铁离子可被吸收并利用来造血。本课题组已通过实验证明，给药当归多糖（ASP）两周以后，正常大鼠肝脏中hepcidin的表达水平明显下降。本次实验主要目的是研究当归多糖抑制正常大鼠hepcidin的表达是否具有量效依赖关系，以及当归多糖抑制正常大鼠hepcidin表达的分子机制。临床检测发现慢性炎症贫血患者体内hepcidin含量显著升高，为进一步研究当归多糖能否通过下调hepcidin的含量对慢性炎症贫血发挥治疗作用，我们采用足跖注射弗氏完全佐剂建立慢性炎症贫血（ACD）大鼠模型。检测灌胃不同浓度当归多糖后ACD大鼠体内hepcidin、血常规、血清铁及炎性因子等指标的变化，研究当归多糖调节ACD大鼠hepcidin表达的分子机制。第一部分不同浓度当归多糖对正常大鼠体内hepcidin表达的抑制作用及分子机制研究采用传统的水煮法从当归饮片中提取当归多糖，合并得到的两次水提液。水提液中加入一定量的Ca（OH）2生成絮状沉淀，除去蛋白质、鞣酸等杂质。滤液加浓硫酸调节PH至5—6，既能除杂又调整了溶液PH，在60℃烘箱中烘干成浸膏状。采用5%苯酚—硫酸法测定当归浸膏的糖含量，用无水葡萄糖配制对照品溶液，绘制标准曲线计算得浸膏糖含量均在70%以上，满足灌胃给药的要求。将48只健康SD雄性大鼠，随机分成6组，每组8只。阴性对照组每天灌胃生理盐水1mL，连续给药20天；阳性对照组分为低剂量组（腹腔注射rhEPO800U/kg）和高剂量组（腹腔注射rhEPO2000U/kg），每日注射一次连续给药3天。实验组大鼠分低、中、高三个剂量，分别灌胃0.3g/kg、0.6g/kg和1.2g/kg当归多糖20天。给药前及给药完成后分别对各大鼠进行一次眼眶取血，用于测定血液相关指标的含量变化。将大鼠处死后取肝脏，烘干至恒重测定肝脏铁含量。结果发现灌胃0.3g/kg、0.6g/kg和1.2g/kg当归多糖组大鼠与给药前相比，血清hepcidin含量分别下降了19.4%,27.1%和31.2%。随着当归多糖给药剂量的增加，对hepcidin的抑制作用增强。腹腔注射rhEPO800U/kg和rhEPO2000U/kg的正常大鼠，血清hepcidin分别下降了24.3%和29.5%。与阴性对照组相比，rhEPO两个剂量组的红细胞、血红蛋白含量均显著升高，而低、中、高三个当归多糖剂量组的红细胞、血红蛋白含量无明显变化。阴性对照组血清铁含量为2.71±0.53mg/L，800U/kg rhEPO和2000U/kg rhEPO组大鼠血清铁含量分别为2.08±0.39mg/L、1.70±0.18mg/L，与阴性对照组比较，EPO显著降低血清铁含量。实验组中只有高剂量（1.2g/kg）当归多糖组血清铁含量显著降低，为1.68±0.27mg/L。阳性对照组的肝脏铁含量也显著降低，同时1.2g/kg当归多糖大鼠肝脏铁含量出现明显的下降，这是因为铁在机体中重新分配以满足红细胞生成的需要。从正常大鼠肝脏提取组织蛋白液，蛋白免疫印迹法（western blot）检测信号因子含量。结果显示，ASP通过下调肝细胞JAK2总蛋白含量，使得p-JAK2相应减少。与JAK2总蛋白含量相比，2000U/kg rhEPO给药组大鼠的p-JAK2含量显著降低，说明EPO主要抑制JAK2蛋白磷酸化过程而不是抑制总蛋白JAK2的表达。ASP和rhEPO均能显著下调p-SMAD1/5/8含量，使得进入细胞核内与hepcidin基因启动子相结合的磷酸化二聚物合成受阻，抑制hepcidin的表达。与阴性对照组相比，ASP和rhEPO给药组的信号蛋白Erk1/2和TMPRSS6含量无明显变化，说明ASP和rhEPO不能通过Erk1/2和TMPRSS6途径抑制hepcidin表达。第二部分不同浓度当归多糖对ACD大鼠体内hepcidin表达的抑制作用及分子机制研究SD雄性大鼠足跖注射100ul含10mg/ml结核分枝杆菌的弗氏完全佐剂（CFA），建立慢性炎症贫血（ACD）模型。注射侧后足在给药后出现原发性肿胀，非注射对侧足和前足在注射后第十天继发肿胀发生明显，耳朵、尾巴红肿甚至出现关节炎“结节”等继发病变。与对照组相比，模型组大鼠红细胞、血红蛋白和血清铁含量降低，分别为6.06×1012/L，92.4g/L和1.78mg/L，而炎症相关指标如白细胞计数、IL-6和TNF-α含量显著升高，分别为2.58×1010/L，84.10pg/ml和68.34pg/ml，弗氏完全佐剂建立的模型符合ACD的发病特征。治疗ACD的关键是抗炎以及改善贫血，实验组的ACD大鼠每天分别灌胃0.5g/kg和1.0g/kg的当归多糖，连续给药4周。阳性对照组是每天给ACD大鼠灌胃10mg/kg双氯芬酸钠，连续给药4周。测量足肿胀，以及检测血常规、hepcidin、血清铁和炎性因子等指标。高剂量当归多糖组（1.0g/kg）比低剂量当归多糖组（0.5g/kg）抑制ACD大鼠hepcidin表达的作用强，抑制率分别为43.1%和28.7%。与模型组大鼠相比，双氯芬酸钠组的血清hepcidin含量也显著降低了38.0%。双氯芬酸钠抑制ACD大鼠原发性足肿胀和继发性足肿胀的作用均强于1.0g/kg当归多糖高剂量组。模型组大鼠白细胞计数2.58×1010/L，给药双氯芬酸钠和1.0g/kg当归多糖治疗后白细胞含量显著下降，分别为1.59×1010/L和1.77×1010/L。双氯芬酸钠和当归多糖均能显著下调ACD大鼠血清炎性因子IL-6和TNF-α的含量，并且双氯芬酸钠的抑制作用更显著。观察足部X光和滑膜苏木素-伊红（H-E）染色切片发现双氯芬酸钠对大鼠关节保护、下调炎症细胞含量的作用最显著。这说明双氯芬酸钠对ACD大鼠的抗炎作用强于1.0g/kg当归多糖。模型组大鼠红细胞计数6.06×1012/L，给药双氯芬酸钠和1.0g/kg当归多糖治疗后红细胞含量显著升高，分别为7.68×1012/L和8.16×1012/L。1.0g/kg当归多糖治疗的ACD大鼠不仅红细胞含量明显增加，与模型组比较，其血红蛋白和血清铁等铁代谢相关指标含量也显著升高，这表明当归多糖（1.0g/kg）对ACD大鼠的―补血补铁‖效果十分显著。高剂量当归多糖对ACD大鼠的治疗作用强于当归多糖低剂量组。Western blot结果显示，当归多糖和双氯芬酸钠均能通过下调ACD大鼠肝脏信号蛋白JAK2、STAT3和p-SMAD1/5/8含量抑制hepcidin的表达。高剂量（1.0g/kg）当归多糖比低剂量当归多糖（0.5g/kg）更显著降低信号蛋白含量。在分别给药当归多糖和双氯芬酸钠的ACD大鼠中，1.0g/kg当归多糖组大鼠的三种信号蛋白含量最低，分别为JAK2含量39.5%、STAT3含量8.1%以及p-SMAD1/5/8含量42.0%。这可能是与双氯芬酸钠相比，1.0g/kg当归多糖能够更显著抑制hepcidin表达的原因之一。