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铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,P.a）是一种常见的机会致病菌,存在范围广,会引起低免疫机体慢性反复感染。P.a易对大部分抗生素产生耐药性,而且耐药机制较为复杂,这也是生物膜形成的主要原因之一。而铜绿假单胞菌感染难以治疗的主要原因就包括生物膜的形成和多种毒力因子的释放以及多重耐药。铜绿假单胞菌中的群体感应（quorum sensing,QS）系统可以调控众多致病因子的表达并在感染过程中起着关键性的作用。P.a所分泌的毒力因子（绿脓菌素、鼠李糖脂、藻酸盐等）和生物膜的形成都是受QS调控的,而且在生物膜的形成中和细菌耐药均起着重要作用。P.a的QS系统主要是lasI/lasR和rhlI/rhlR两个系统,这两套系统可启动其他相关的基因调控,共同促进细菌生物膜的产生。因此,若能有效降低或阻断QS系统相关基因的表达,从而减少毒力因子的产生,寻找出可靠的QS阻断物,则有可能抑制P.a生物膜的形成,这也是目前治疗生物膜感染的一个很有前景的治疗手段。而抗微生物肽（Antimicrobial peptides,AMPs）具有广谱抗微生物的活性,作为一类不易产生耐药性的抗菌剂,被广泛认为有望成为抗生素的替代品。为控制生物膜细菌感染和解决铜绿假单胞菌耐药提供了一个新的主题方向。本课题以铜绿假单胞菌的野生型标准株PAO1为试验株,通过构建体外生物膜,探讨了抗微生物肽CRAMP联用抗菌药对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响,以及考察了对PAO1生物膜的主要毒力因子释放的抑制作用和P.a生物膜群体感应系统中相关调控基因lasR/lasI、rhlR/rhlI的mRNA表达水平。第一部分抗微生物肽CRAMP联合抗菌药对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响目的:筛选出CRAMP与抗菌药联用抑制生物膜形成的最理想配伍方法:采用96孔细胞培养板构建生物膜,检测PAO1生物膜量,考察初筛选的配伍在亚抑菌浓度下对PAO1生物膜形成的影响;采用96孔细胞培养板结晶紫染色法测定生物膜量和活菌计数,以及协同系数的计算,最终选出理想配伍及干预浓度等条件。最后,通过6孔细胞培养板检测理想配伍作用下的PAO1生物膜量和生物膜菌计数,以及激光共聚焦显微镜（CLSM）观察形态学变化进一步验证其作用。结果:96孔板结晶紫测定PAO1生物膜量,初步筛选出妥布霉素（TOB）与硫酸多粘菌素（COL）为理想联用药物;结晶紫和活菌计数结果显示1/2MIC CRAMP在生物膜建模的浮游菌阶段有显著影响,而1/4MIC CRAMP与空白孔相比无显著差异。协同系数算出妥布霉素的协同作用优于硫酸多粘菌素,但妥布霉素在1/2MIC～1/8MIC浓度下均对生物膜建模的浮游菌阶段有显著影响,而硫酸多粘菌素无显著差异。因此最终选用1/4MIC CRAMP与不同亚抑菌浓度的硫酸多粘菌素（1/4、1/8、1/16MIC）进行配伍使用。6孔细胞培养板结晶紫法测定生物膜量,1/4MIC CRAMP+1/4MIC COL与1/4MIC CRAMP+1/8MIC COL与空白孔相比均能极显著减少生物膜量（P<0.001）,但生物膜活菌计数结果显示仅有1/4MIC CRAMP+1/4MIC COL能显著减少生物膜活菌数,最终选用1/4MIC CRAMP+1/4MIC COL配伍组合。激光共聚焦显微镜（CLSM）结果显示1/4MIC CRAMP+1/4MIC COL能有效减少生物膜量,对生物膜形成具有明显的协同作用,且效果优于空白组和单用药组。结论:通过生物膜量检测、生物膜活菌计数和CLSM形态学观察,筛选并验证了1/4MIC CRAMP+1/4MIC COL对PAO1生物膜形成有明显协同作用。第二部分CRAMP联合硫酸多粘菌素对PAO1生物膜常见毒力因子的影响目的:观察CRAMP联合硫酸多粘菌素对铜绿假单胞菌生物膜相关毒力因子的抑制作用。方法:6孔细胞培养板体外构建生物膜,同时设立空白组,单用药组（1/4MIC CRAMP和1/4MIC COL）以及联合用药组（1/4MIC CRAMP+1/4MIC COL）,检测藻酸盐和鼠李糖脂的含量;弹性蛋白酶-刚果红法测定菌液中弹性蛋白酶活性;偶氮酪蛋白法测定菌液中蛋白水解酶活性;氯仿萃取法测定共培养14h绿脓菌素的活性。结果:粘菌素组（1/4MIC COL）和联合用药组（1/4MIC CRAMP+1/4MIC COL）与空白组相比能有效减少绿脓菌素的产生（P<0.05）;联合用药组（1/4MIC CRAMP+1/4MIC COL）与空白组相比能显著减少藻酸盐的含量（P<0.01）;粘菌素组1/4MIC COL能有效减少鼠李糖脂的含量（P<0.05）,而联合用药（1/4MIC CRAMP+1/4MIC COL）极显著降低鼠李糖脂的含量（P<0.01）;但弹性蛋白酶和蛋白水解酶活性无论是单用药组还是联合用药组均显著提高。结论:粘菌素组（1/4MIC COL）和联用药组（1/4MIC CRAMP+1/4MIC COL）均可以抑制P.a的多种毒力因子的释放,其中联用药组对藻酸盐和鼠李糖脂的抑制效果明显优于单用药组。第三部分CRAMP联合硫酸多粘菌素对PAO1生物膜QS系统相关基因mRNA水平的影响目的:主要研究CRAMP联合硫酸多粘菌素对PAO1生物膜QS系统相关基因（lasI/lasR和rhlI/rhlR）mRNA水平的影响方法:6孔细胞培养板体外构建生物膜,提取生物膜的总RNA,逆转录合成c DNA,采用TB Green荧光嵌合法测定基因表达水平检测生物膜菌lasR、lasI、rhlR、rhlI基因的表达量变化,以rpsL为内参基因。结果:1/4MIC CRAMP+1/4MIC COL联合用药均可显著下调PAO1生物膜QS系统相关基因lasI、lasR、rhlR、rhlI的mRNA水平（P<0.05 or 0.01）,单用药组1/4MIC COL仅明显下调rhlR的mRNA水平（P<0.01）。结论:亚抑菌浓度的粘菌素和抗微生物肽CRAMP联用（1/4MIC CRAMP+1/4MIC COL）可显著降低P.a生物膜的形成和QS系统相关基因（lasR、lasI、rhlR、rhlI）的mRNA表达水平,其抑制效果优于单用药组。