一、背景细菌、病毒、真菌和寄生虫病原体以及这些病原体的代谢产物所引起的感染性疾病,迄今仍然是人类死亡和伤残的主要原因之一,每年全球引起1700万以上的新发病例。尿路感染(Urinary tract infection, UTIs)是临床感染中第二位的感染。女性因生理原因,较男性易感。大约有81%的UTIs发生在女性,年龄在16到35岁之间,30岁的妇女中有1/3-1/4都有过急性尿路感染的病史,并且复发率高。其次,UTIs也是免疫力低下人群常见的感染性疾病。尿路感染按解剖部位不同分为尿道下部感染和上行性感染,前者包括尿道炎和膀胱炎,后者指肾盂肾炎。肾盂肾炎是尿路感染最严重的形式,当病史超过半年至一年就有转成慢性肾盂肾炎的可能性,而慢性肾盂肾炎久治不愈是肾功能衰竭较常见的原因之一。尿路致病性大肠埃希菌(Uropathogenic Escherichia coli, UPEC)引起的UTIs占80%-90%大部分尿路致病菌都起源丁肠道,并经尿道上行至膀胱,约95%的UTIs的起始感染部位是膀胱。目前主要的研究重点是围绕UPEC与宿主之间的关系展开的。UPEC与其它致病性大肠埃希菌一样,染色体上具有毒力因子信息。UPEC相关毒力因子包括：α-溶血素、细胞坏死因子、转铁蛋白等；一方面,细菌通过这些毒力因子在宿主中达到存活繁殖的目的；另一方面宿主利用机体免疫系统,防御来自细菌的攻击,发生炎症反应；在不断的相互作用过程中,细菌产生一些酶抵抗来自宿主的防御系统。比如,本次实验中发现UPEC毒力因子ompT可水解人固有免疫成分人防御素,从而为细菌在宿主体内存活提供条件。在尿路感染中,细胞因子是宿主免疫细胞产生的一大类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。本文以尿路感染动物模型为基础,扩展思路,测定宿主不同组织细胞因子的表达水平,为进一步深入尿路感染的机制提供依据。UPEC对宿主尿路上皮细胞的粘附能力是其致病的最重要因素,荚膜、脂多糖等一些粘附器官及粘附素的表达常常是致病的关键,其有助于UPEC结合于尿路进而避免被尿液冲刷清除。本次试验研究表明：ompT基因的敲除,可能导致FimH基因表达的下调；FimH是一种已经验证的粘附素,并且前期体内及体外结果也表明,ompT基因的敲除可使UPEC粘附率下降,与前期实验结果一致。UPEC毒力因子的存在和毒力的大小决定了所致疾病的种类和严重程度；以相同方法,比较ompT对其他毒力基因的调控,也在本文中做了初步探讨。这些毒力基因功能多与粘附、侵袭、血清抗性和代谢等相关,并在实验过程中证实。关于ompT调控这些毒力因子的相关机制还未得到实验证实。本研究利用前期RED同源重组系统构建的尿路致病性大肠杆菌CFT073的ompT基因敲除株(CFT073ΔompT),并将ompT基因连接至低拷贝质粒pUCT中构建回补株(ompT/pUCT),考察ompT基因的缺失对致病株抵抗人防御素的影响。并通过参考文献及蛋白功能预测得到,ompT通过调控某些毒力蛋白前体成分的表达而在尿路感染中起作用；并且通过荧光定量PCR验证ompT基因刘‘主要毒力蛋白表达的影响。本课题的目的在于初步研究基因ompT在尿路致病性大肠杆菌的致病机理中所起到的作用。二、研究方法1、人防御素HBD-4克隆、表达以及鉴定为进一步研究OmpT在尿路感染致病机理中所起的作用,克隆表达人β类防御素HBD-4模拟体外感染环境。本实验以膀胱癌细胞总RNA为模板,PCR扩增HBD-4基因,连接至pET-28a,构建表达载体pET28a-HBD-4。(?)重组质粒转化入BL21(DE3),经IPTG诱导后HBD-4表达。纯化后恢复蛋白活性。通过SDS-PAGE检测。2、人防御素HBD-4抑菌活性检测将对数生长期的大肠埃希菌CFT073、CFT073△ompT和ompT/pUCT(CFU：1×106)40μl接种于的LB培养基中,再加入10μl防御素蛋白HBD-4孵育,使每管HBD-4蛋白的终浓度为200μg/ml。将培养物37℃孵育8h,间隔一小时在600nm处测定各管的吸光度。将各管稀释106倍后均匀涂布于LB固体培养基上,37℃孵育过夜后菌落计数。每种细菌均做副管。3、尿路感染动物模型的建立经尿路分别灌注CFT073及CFT073△ompT,建立尿路感染小鼠动物模型,继续饲喂12h,观察小鼠活动情况。12h后处死小鼠,腹部消毒,取出膀胱；用PBS清洗5-10次；加入1ml PBS后匀浆,匀浆液作1：1000、1：10000、1：100000梯度稀释。取出10μ1稀释液均匀涂布于LB平板,12h后菌落计数。4、尿路感染细胞因子的检测C57小鼠随机分组,按尿路灌注方法分别接种野生株细菌、敲除株细菌以及回补株细菌,细菌接种完毕12h后分别取小鼠血液、肾脏及膀胱组织。血液样本离心20rmin(2000-3000rpm/min),仔细收集上清；肾脏及膀胱组织分别加入1m1PBS缓冲液匀浆,离心,取上清。将上述样品分别加入预制酶标包被板中,按试剂盒说明书操作,温浴、洗涤、加酶、显色后,终止反应。置入酶标仪,以空白孔校正,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。绘制标准曲线,计算各组细胞因子水平。5.ompT基因的调控作用由于Ⅰ型菌毛中FimH为证实的粘附素,因此利用qPCR定量CFT073以及CFT073△ompT中fimH表达情况。CFT073以及CFT073ΔompT培养过夜,离心加TRIzol裂解,有机溶剂抽提总RNA,反转录；以16s-RNA为内参基因,SYBR-Green染料法计算野生株与敲除株中fimH基因的表达量是否有差异。以相同方法分别计算两种细菌中ompA、Hly、CNF1的表达的差异。6、统计学分析数据分析利用SPSS13.0软件,检验水准为a=0.05,P<0.05认为差异有统计学意义。防御素对CFT073、CFT073ΔompT及ompT/pUCT的抑菌作用采用单向方差分析(One-Way ANOVA);野生株及敲除株中fimH、ompA、Hly、CNF1的表达差异采用独立样本t检验(Independent-Samples T test)。三、结果1、HBD-4的表达成功构建表达载体pET28a-HBD-4,转化入工程菌BL21中,成功表达纯化并复性HBD-4。2、防御素对CFT073、CFT073ΔompT及ompT/pUCT抑菌作用经稀释106倍后菌落计数观察,CFT073组有269±19个菌落形成单位,CFT073ΔompT组有5+4个菌落形成单位,ompT/pUCT组有232±19个菌落形成单位；各组方差齐,F=259.3,P<0.001,按a=0.05水准,有统计学意义,认为三组间菌落形成单位总体均数不全相等,多重比较显示,ompT敲除株菌落形成单位明显少于野生株及回补株。观察生长曲线,防御素刘CFT073△ompT有较强的抑制,在波长600处OD值变化小。CFT073生长基本不受影响,ompT/pUCT虽然生长受到影响,但总体依然呈增殖状态。3、野生和敲除株细菌在小鼠体内存活数的比较通过小鼠膀胱灌注,以及菌落计数。经多个独立样本非参数检验。分析结果显示,X2=20.099,v=2,P<0.001,三组间差异有显著性意义。野生株小鼠体内存活平均秩次为23.00,突变株为14.00,表明ompT基因敲除后细菌体内存活数减少。4、测定小鼠组织中细胞因子水平尿路感染小鼠动物模型建模成功。ELISA法检测细胞因子,在血浆中,三组细胞因子水平不同(F=12.268,P<0.05)；两两比较后,敲除株与野生株不同,回补株与野生株不同,初步认为在血液中,三组细菌所致炎症程度不同,野生株强于敲除株及回补株。在肾脏组织中,三组细菌因子水平不同(F=6.155,P<0.05)；两两比较后,敲除株与野生株不同,回补株与野生株不同,初步认为在肾脏组织中,三组细菌所致炎症程度不同,野生株强于敲除株及回补株。在膀胱组织中,三组细菌因子水平还不能认为不同,三组细菌所致炎症程度相当。5、omp T对毒力基因表达的调控相对荧光定量显示,野生株fimH基因表达量是敲除株的79倍。另外比较野生株和敲除株内参基因16s-rRNA的光密度,t=-1.006,P>0.05,野生株和敲除株光密度之间无差异,表明RNA提取无差异；所以,野生株fimH基因表达可能强于敲除株,ompT敲除可能下调了fimH基因的表达。相同方法扩增野生株和敲除株中ompA基因后,野生株ompA基因表达可能强于敲除株；ompT可能同样影响基因ompA的表达。相同方法分析Hly基因,野生株Hly基因表达可能强于敲除株；表明ompT对基因Hly的表达有一定影响。相同方法分析CNF1基因,野生株CNF1基因表达可能强于敲除株；ompT可能影响基因CNF1的表达。四结论1、成功表达纯化复性HBD-4后,ompT(?)敲除株较野生株及回补株对HBD-4更敏感；ompT可通过水解人防御素,有利于UPEC在尿路中存活。2、在成功构建小鼠尿路感染模型的基础上,通过体内实验表明,ompT基因的敲除可影响细菌体内存活及体内炎症反应。3、荧光定量PCR表明,ompT基因的敲除下调了fimH的表达。表明ompT基因可能通过影响FimH的表达而在粘附中起作用。相同方法分析,ompT可能对ompA基因、hly基因及CNF1基因的表达也有影响。