猪肝羧酸酯酶(pig liver carboxylesterase,PLE)是哺乳动物同类酶中最复杂的酶家族。目前本研究团队已克隆到包括已报道7种亚型在内的108种PLE同工酶,其中出现频率较高的有55种。哺乳动物羧酸酯酶具有高度的酶活性和底物灵活性,可以水解多种内外源性物质而发挥不可替代的药理学和毒理学作用,但对其生理作用却知之甚少,这与羧酸酯酶在体内分布的丰度不相称。另有研究表明,人类CES可以水解内源性大麻素,这给PLE在生理作用方面的研究提供了思路。常见的内源性大麻素有2-AG和AEA两种,其在机体内按需合成并具有抑炎的作用,主要由经典的大麻降解酶MAGL和FAAH水解。PLE与经典的大麻素降解酶同属于丝氨酸水解酶家族,且2-AG和AEA分别含有可供PLE水解的酯键和酰胺键,有理由推测PLE可能通过水解大麻素调控炎症水平。为证明PLE在炎症反应中的作用并阐明其作用机制,本研究首先原核功能性表达PLE1和PLE6两种亚型,进行体外水解内源性大麻素研究,发现PLE1和PLE6都能够水解大麻素2-AG,且PLE6水解2-AG酶活力水平高达62.7nmol/min/mg。这为研究PLE调控炎症反应机制提供了直接的依据。本研究团队前期研究发现PLE主要分布在肝脏,因此,本研究用含有丰富PLE的成年猪肝脏S9体外水解大麻素2-AG和AEA。研究证明,肝脏S9不仅可以水解大麻素2-AG和AEA,且经羧酸酯酶特异性抑制剂BNPP处理后,成年猪肝脏S9水解内源性大麻素酶活力水平下调,证明肝脏中PLE可水解内源性大麻素。PLE定位在细胞的内质网腔中,只能对进入细胞内的物质发挥水解作用。因此,本研究选择293T细胞系过表达含有信号肽的PLE6,在活细胞水平,试验大麻素2-AG是否可进入细胞内并被PLE水解。LC-MS/MS检测2-AG水解产物花生四烯酸(Arachidonic,AA),结果在细胞培养基中、细胞培养基和细胞混合物中发现产物AA均显著高出对照组,表明大麻素2-AG能够进入细胞、并被定位于内质网腔中的PLE水解,也提示机体产生的内源性大麻素能进入细胞从而被PLE水解,为PLE调控机体炎症机制的研究打下良好的基础。PLE水解内源性大麻素后可生成AA,AA又为前列腺素的前体物质。因此PLE水解大麻素参与炎症反应的调节较复杂。为此,本研究建立了原代猪肝细胞、原代枯否氏细胞、原代淋巴细胞共培养模型,探究机体中的PLE对炎症反应的调控机制。首先,外源添加2-AG处理LPS诱导的共培养细胞炎症模型,蛋白质芯片检测结果证明2-AG发挥抑炎作用。其次,用重组PLE6水解过的2-AG处理LPS诱导的共培养细胞炎症模型,蛋白质芯片检测结果表明PLE水解2-AG后发挥促炎作用。然后,用羧酸酯酶特异性抑制剂BNPP处理LPS诱导的共培养细胞炎症模型,蛋白质芯片检测结果表明BNPP抑制PLE后发挥抑炎作用,即PLE发挥促炎作用。经以上研究证明2-AG具有抑炎作用、PLE水解大麻素发挥促炎作用。最后,用BNPP处理共培养细胞模型3h后,再添加大麻素2-AG作用于LPS诱导的共培养细胞炎症模型,蛋白质芯片检测结果表明BNPP能显著下调2-AG作用后LPS诱导的炎症水平,进一步证明PLE水解大麻素发挥促炎作用。由于原代枯否氏细胞分离到的数量有限,本研究则加入MoDC和肺泡巨噬细胞系,即为原代猪肝细胞、MoDC、KCs和肺泡巨噬细胞系4种细胞共培养。首先,荧光定量检测结果证明2-AG在共培养细胞炎症模型中发挥抑炎作用。其次,本研究外源添加PLE1和PLE6重组蛋白于共培养细胞炎症模型,蛋白质芯片结果为PLE1和PLE6均发挥促炎作用。最后,选用BNPP处理LPS诱导的共培养细胞炎症模型,蛋白质芯片检测结果为BNPP显著抑制LPS诱导的炎症水平,证明PLE在共培养细胞炎症模型中发挥促炎作用。以上研究结果与三种共培养细胞模型研究结果相一致。最后,用经典的大麻素降解酶MAGL抑制剂JZL184,对比MAGL与PLE在炎症细胞模型中的作用,蛋白质芯片检测结果为JZL184下调LPS诱导的炎症水平,表明PLE与MAGL对炎症反应的调节趋势相同。