研究背景:血管钙化在老年人、慢性肾脏病患者、2型糖尿病和动脉粥样硬化中增加心血管疾病的死亡率[1-3]。在心血管系统,血管钙化是以钙和磷酸盐聚集为特征。血管钙化可以在血管内膜和中膜中发展,同时在心脏瓣膜中也会发生[4]。血管钙化的平衡来自于促钙化因子和抑制钙化因子的调节[5]。增加的钙离子和磷水平、炎症、血管损伤都会导致内皮细胞转换为成骨细胞表型,表达Runx2、TNAP、BMP2、BMP4骨相关蛋白分子[6]。最近的研究表明血管钙化是心血管事件准确的预测者,包括心肌梗死和中风。血管钙化的发病机制包括血管平滑肌细胞向骨软骨细胞的转化、凋亡、基质小泡释放、基质重塑。令人信服的证据表明血管钙化的过程是一种类似于骨形成主动调节的过程。然而,这个过程详细的机制需要进一步探索,有趣的是PTH已经被报道参与骨的形成,PTH可以促进成骨细胞基质矿化,同时PTH也可以诱导血管钙化[7,8]。此外,促钙化的环境促进血管细胞凋亡,同时释放凋亡小体形成羟基磷灰石[9]。在体外,凋亡调控血管平滑肌钙化,抑制凋亡可以减轻血管平滑肌钙化。然而,升高的PTH水平和凋亡之间的联系在血管钙化进程中潜在的机制需要进一步探讨。PTH是甲状旁腺主细胞分泌的多肽类激素。主要作用于骨骼和肾脏,具有维持人体内钙磷代谢平衡的作用,总的效应是升高血钙和降低血磷。最近研究发现,PTH也可作用于心血管系统,引起心率增快、冠状动脉血流量增加、左心室肥厚、心律失常及瓣膜钙化[10,11]。在临床中发现,甲状旁腺功能亢进患者引发心血管事件的病死率明显高于普通人群[12]。同时PTH通过膜表面PTH受体也影响其他器官、组织和细胞比如内皮细胞的功能。在透析的病人中研究显示PTH水平与瓣膜钙化、炎症标志物显著相关。PTH除了激活成骨细胞和破骨细胞外,在各种组织中,PTH也被证实具有免疫调节和促炎症作用,这种作用包括诱导细胞因子分泌和炎症细胞招募[13,14]。同时PTH也可以通过内皮间充质转换诱导内皮细胞表型转换导致细胞钙化[15]。PTH可以激活Jagged1/Notch1通路在成骨细胞中,但是在钙化过程中的作用还是未知的[16]。最近研究表明在人的钙化主动脉瓣膜中高表达Notch1蛋白[17]。在我们的研究中,我们使用PTH诱导的体外钙化模型探讨PTH在血管钙化中的作用机制。PTH以剂量依赖的浓度促进人脐静脉内皮细胞钙化,同时,PTH增加成骨相关因子的表达包括BMP2、BMP4。此外,流式细胞仪分析显示PTH显著增加人脐静脉内皮细胞的凋亡,表明PTH在血管钙化中起到了重要作用。而且,我们发现PTH刺激人脐静脉内皮细胞后促凋亡相关分子Cleaved caspase3、Bax上调,而抑凋亡分子Bcl-2下调。PTH刺激人脐静脉内皮细胞可以上调Jagged1、Notch1分子表达,综上所述,这些发现揭示PTH可能通过Jagged1/Notch1通路诱导人脐静脉内皮细胞凋亡促进血管钙化。研究目的:1.探讨甲状旁腺素促进人脐静脉内皮细胞成骨样分化、钙化及人脐静脉内皮细胞凋亡的机制。2.阐明甲状旁腺素促进人脐静脉内皮细胞钙化与Jagged1/Notch1通路有关。研究方法:1.Western blot和q PCR检测BMP2和BMP4的蛋白和基因表达:实验采用第5-8代的人脐静脉内皮细胞,不同浓度PTH(10-11mmol/l、10^-10mmol/l、10-9mmol/l、10-8mmol/l)处理人脐静脉内皮细胞5天后,Western blot检测骨形态发生蛋白BMP2、BMP4的表达水平,q PCR检测人脐静脉内皮细胞成骨样分化的相关分子m RNA表达水平。2.Western blot检测PTH1R、BMP2和BMP4蛋白表达:各组si RNA转染PTH受体（PTH1R）后BMP2、BMP4蛋白的表达情况,可见si RNA-3的干扰效果最佳,后续研究采用si RNA-3。PTH1R在人脐静脉内皮细胞表达,并且PTH1R表达被PTH1R-si RNA阻断。用Western blot法检测PTH1R在人脐静脉内皮细胞的表达,使用RNA干扰技术阻断PTH1R表达,10-8mmol/l PTH处理细胞,Western blot检测PTH1R被敲除后PTH诱导BMP2、BMP4蛋白表达。3.Western blot和q PCR检测Jagged1、Notch1、BMP2和BMP4蛋白表达:我们应用Notch1特异性配体Jagged1激活Notch1信号通路,然后检测PTH诱导的骨形态发生蛋白BMP2、BMP4的表达。我们应用Jagged1溶液（5ug/ml）预处理48小时,再用PTH处理3天,Western blot检测骨形态发生蛋白BMP2、BMP4的表达;不同浓度PTH处理脐静脉细胞5天,Western blot检测Jagged1、Notch1蛋白的表达;Notch1的γ分泌酶抑制剂DAPT预处理HUVEC48小时后,再加入PTH处理3天,Western blot检测PTH诱导的Notch1蛋白的表达,RT-PCR检测Notch1 m RNA水平表达。4.流式细胞仪检测细胞凋亡率及Western blot检测Cleaved caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表达:不同浓度PTH(10-11mmol/l、10^-10mmol/l、10-9mmol/l、10-8mmol/l)处理人脐静脉内皮细胞5天后,流式细胞仪检测HUVECs细胞的凋亡率,Western blot检测不同浓度PTH诱导的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白表达;我们应用Jagged1溶液（5ug/ml）预处理48小时,再用PTH处理3天,Western blot检测促凋亡蛋白（cleaved caspase3 and Bax）的表达;不同浓度PTH处理人脐静脉内皮细胞5天,Western blot检测促凋亡蛋白表达情况。5.Western blot检测BMP2、BMP4、Cleaved caspase3和Bax蛋白表达及q PCR检测BMP2、BMP4、ALP、Runx2基因水平表达:应用Notch1的γ分泌酶抑制剂DAPT预处理HUVEC48小时后,再加入PTH处理3天,Western blot检测PTH诱导的骨形态发生蛋白BMP2、BMP4表达及促凋亡蛋白的表达。q PCR检测成骨分化相关因子BMP2、BMP4、ALP、Runx2 m RNA水平表达。研究结果:1.PTH促进人脐静脉内皮细胞成骨分化和钙化:PTH对人脐静脉内皮细胞BMP2、BMP4蛋白和m RNA表达水平的影响,PTH(10-11mmol/l、10^-10mmol/l、10-9mmol/l、10-8mmol/l)处理5天后呈浓度依赖性地促进人脐静脉内皮细胞的BMP2、BMP4蛋白表达,以10-8mmol/l时最为显著（P<0.05）,Western blot检测BMP2、BMP4蛋白表达与对照组比较上调（P<0.05）,通过RT-PCR检测BMP2、BMP4m RNA表达水平与对照组比较上调（P<0.05）。2.PTH1R受体在PTH诱导人脐静脉内皮细胞中的作用:各si RNA转染PTH受体（PTH1R）后BMP2、BMP4蛋白的表达情况,可见si RNA-3的干扰效果最佳,后续研究采用si RNA-3。人脐静脉内皮细胞先用PTH1R si RNA（50u M）和Scrambled si RNA（50u M）预处理48小时,然后用PTH（10-8mmol/l）处理72小时。Western blot检测PTH1R沉默减少人脐静脉内皮细胞PTH诱导BMP2、BMP4蛋白的表达（P<0.05）。3.PTH促进人脐静脉内皮细胞Jagged1、Notch1蛋白表达:PTH(10-11mmol/l、10^-10mmol/l、10-9mmol/l、10-8mmol/l)刺激人脐静脉内皮细胞5天后,呈浓度依赖性地促进HUVEC的Jagged1、Notch1蛋白表达,以10-8mmol/l时最为显著（P<0.05）,Western blot检测Jagged1、Notch1蛋白表达,RT-PCR检测Jagged1、Notch1 m RNA表达水平。应用Notch1特异性配体Jagged1激活Notch1信号通路,然后检测PTH诱导的钙化,用Jagged1蛋白预处理细胞24小时,然后用PTH处理细胞5天,通过Western blot检测BMP2、BMP4的蛋白表达。我们应用Notch1的γ分泌酶抑制剂DAPT预处理HUVECs24小时后,再加入PTH处理5天,Western blot显示PTH诱导的Notch1蛋白的表达下降（P<0.05）,RT-PCR显示Notch1 m RNA水平表达下降（P<0.05）。4.PTH促进人脐静脉内皮细胞凋亡:AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率发现:对照组细胞凋亡率为14.45%（14.45±0.30%）,PTH处理浓度为10-11mmol/l时细胞凋亡率为16.76%（16.76±0.56%）,10^-10mmol/l组细胞凋亡率为20.52%（20.52±0.98%）,10-9mmol/l组细胞凋亡率为22.90%（22.90±0.60%）,当PTH达10-8mmol/l时细胞出现明显凋亡,总凋亡率为26.75%（26.75±0.45%）,凋亡率较对照组明显升高（P<0.05）,较其他处理组也明显升高,且以中晚期凋亡为主。PTH(10-11mmol/l、10^-10mmol/l、10-9mmol/l、10-8mmol/l)处理5天后呈浓度依赖性地促进内皮细胞的Cleaved Caspase3、Bax蛋白表达,以10-8mmol/l时最为显著（P<0.05）,Western blot检测促凋亡相关蛋白（Cleaved Caspase3、Bax）和抑凋亡相关蛋白（Bcl-2）表达与对照组比较显著表达上调（P<0.05）。5.抑制Jagged/Notch1信号对脐静脉内皮细胞钙化和凋亡的影响:Notch1特异性γ分泌酶抑制剂DAPT显著抑制PTH诱导的BMP2、BMP4蛋白表达,同时也显著抑制PTH诱导细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase3、Bax的表达,Western blot显示DAPT抑制PTH诱导的BMP2、BMP4表达和凋亡蛋白Caspase3、Bax蛋白表达与对照组相比较（P<0.05）,RT-PCR显示DAPT抑制PTH诱导的BMP2、BMP4、Runx2和ALP的m RNA水平表达与对照组相比较（P<0.05）。研究结论:甲状旁腺素（PTH）可促进人脐静脉血管内皮细胞成骨样分化和钙化,同时可促进人脐静脉血管内皮细胞凋亡。另外,甲状旁腺素可上调Jagged1、Notch1的表达水平,抑制Jagged1/Notch1通路能明显下调人脐静脉血管内皮细胞成骨分化和钙化。甲状旁腺素促进人脐静脉血管内皮细胞成骨样分化和钙化,其机制可能是通过Jagged1/Notch1信号通路介导的凋亡有关。