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杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒,其基因组大小为80-180kb,在自然界中以节肢动物作为专一性宿主进行感染和传播。杆状病毒区别于其他病毒的一个特点是其具有两种不同的病毒粒子形态:一种为出芽型的病毒粒子(buddedvirus.BV),主要介导细胞与细胞之间的系统感染,入侵细胞是通过受体介导的内吞作用；另一种为包埋型的病毒粒子(Occlusion-derivedvirus,ODV),在病毒的口服感染过程中,以直接的膜融合方式入侵中肠上皮细胞,但由于缺乏有效的体外感染模型,口服感染的分子机制仍未得到明确的解释。目前,已鉴定出有五种口服感染因子(Perosinfectivityfactors)--P74,PIF1,PIF2,PIF3,PIF4与口服感染成功与否密切相关,并且发现P74,PIF1,PIF2参与了ODV与BBMV受体的结合。根据已有的报道,ODV是通过膜融合方式侵入中肠上皮细胞,我们推测ODV表面很可能存在一类发挥膜融合功能的蛋白,因此,本文围绕着鉴定ODV的膜融合蛋白这一目标,选择了棉铃虫核多角体病毒(Helicoverpaarmigera(Hear)NPV)口服感染因子P74,PIF1,PIF2和PIF3作为研究对象开展了一系列工作。本论文将从以下五个章节进行论述:
第一章:文献综述。对杆状病毒的研究背景和口服感染相关基因的研究进展进行了系统的综述,同时也对本研究的研究意义和内容进行了简单的介绍。
第二章:HearNPV口服感染因子的原核表达。构建跨膜区截短型pifs基因片段,克隆至原核表达载体pET28a,pET32a或pGEX-KG,将这些重组质粒转入表达宿主菌株BL21,用IPTG诱导表达。实验结果显示:全部PIFs蛋白均得到高效表达,其中PIF3的表达产物部分可溶,有些PIFs蛋白虽获得了高效表达,但产物以包涵体形式存在于细胞沉淀中。本实验获得的可溶表达PIF3可用于后续结构生物学研究。
第三章:昆虫细胞表面展示系统的构建及HearNPVPIFs蛋白的在昆虫细胞中的展示。由于ODV囊膜蛋白定位于核膜而非细胞质膜,无法进行膜融合诱导实验。本章中通过构建昆虫细胞表面展示载体,将外源蛋白表展示于细胞质膜,以期建立筛选ODV膜融合蛋白的平台。以瞬时表达载体p166AcV5为基础,构建了一系列含N端融合病毒膜蛋白信号肽、C端融合病毒膜蛋白跨膜相关结构域的绿色荧光蛋白基因(egfp)的载体。其中,N端融合AcMNPVGP64信号肽、C端融合VSVGstem结构的表面展示载体(p166AcV5-GP64sp-EGFP-VSVGstem)在转染昆虫细胞后绿色荧光蛋白在细胞膜表面有显著分布,表明我们成功构建了昆虫细胞表面展示系统。将截掉跨膜区的HearNPVPIF1,PIF2,PIF3和P74通过该系统展示于HzAM1和sf9细胞表面,并进行pH诱导,但未观察到膜融合现象。为了检测PIFs是否得到成功展示,在PIFs与VSVGstem结构间插入EGFP,在转染细胞中未检测到融合蛋白的荧光信号。
第四章:HearNPVP74七肽重复区(HR区)的圆二色谱分析。通过生物信息学分析,我们预测HearNPVP74可能存在三个七肽重复区(Heptadrepeat,HR),参照ClassⅠ病毒膜融合蛋白的研究方式,选取Furin-like蛋白酶剪切位点下游,靠近C端的两个七肽重复区NHR和CHR进行人工多肽合成,并通过圆二色谱(CD)分析了这两条多肽的二级结构及相互作用关系。CD结果显示:在非极性缓冲液里,NHR易溶于溶剂,呈现α-helix结构；CHR微溶于溶剂,未呈现明显二级结构;当pH为10.0时,NHR和CHR发生相互作用,使α-helix结构得到增强；当pH等于4.0,5.0或者7.0时,NHR和CHR未见明显相互作用。这提示P74的NHR和CHR可能在虫体生理条件(碱性环境下)中发挥功能。同时,我们还成功构建HR区点突变的重组病毒,为后续的生物测定做准备。
第五章:HearNPVP74的蛋白酶剪切研究。用HearNPVODV分别与胰蛋白酶(Trypsin)孵育,发现P74能以剂量依赖的方式被Trypsin剪切,产生大小约为40kDa并含有N端序列的蛋白,命名为S片段。进一步用棉铃虫中肠刷状缘膜囊颗粒(BBMV)与HearNPVODV进行孵育,也检测到被剪切下的、类似S片段大小的条带,说明该剪切可能在病毒天然的感染过程中发挥重要作用。将Trypsin酶解HearNPVODV后产生的S片段从SDS-PAGE中割下,用Qtrap串联质谱进行分析,确认S片段是由P74特异性剪切产生的。通过氨基酸序列分析,我们推测HearNPVP74的剪切位点可能不同于AcMNPVP74的剪切位点(RRFGR195-199aa),表明HearNPV和AcMNPV的P74在剪切激活机制可能存在差异。