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背景：鉴于微血管的管径小和血流速度缓慢,他们容易被各种栓子闭塞,如血栓、动脉粥样硬化碎片或循环中产生的其他碎片栓子等。目前发现维持血流通畅的机制包括血流动力学机制、纤溶系统溶解机制和血管吞噬外渗栓子机制,分别导致栓子的洗脱、溶解或外渗。血管吞噬是近几年新发现的一种微血管清除栓子的机制,涉及到血管内皮对栓子的包裹继而栓子穿过内皮细胞排出到周围脑组织的过程,血管吞噬外渗栓子使得阻塞的血管实现再通。研究发现血管吞噬发生在小鼠的脑、心脏、肾脏、肺等多个器官,是一种广泛存在的清除栓子的机制,在小鼠脑微血管,血管内皮吞噬包裹微栓子最早发生在微栓塞后1 h,却也会相应的阻碍血流动力学和纤溶系统对栓子的清除和溶解。间接证据表明血管吞噬外渗栓子的现象也发生在人的视网膜微血管。然而血管吞噬的确切机制仍然未知,整合蛋白、肌动蛋白及细胞骨架重构等可能参与到了内皮包裹栓子的过程中,而栓子的外排过程则可能涉及到内皮细胞紧密连接及细胞外基质的重塑等,CD31、紧密连接蛋白ZO-1、胶原IV和基质金属蛋白酶(MMPs)等可能参与其中。动脉粥样硬化(AS)是一种慢性炎症性血管疾病,它的特点是内膜损伤后大量胆固醇等脂质沉积产生的粥样硬化斑块及增长的斑块导致的管腔的缩小,血管内皮损伤是AS的一个重要的病理和始动因素。血管内皮功能的障碍,可发生在血管疾病出现明显的结构病变之前。鉴于血管吞噬作用是微血管内皮清除栓子以维持血流通畅的一种保护性作用,那么AS时血管吞噬的功能是否会受到影响以及受到怎样的影响,暂时还缺少相关的研究。清脑通络方是国医大师张学文教授创立的,原是用于预防和治疗小中风的经验方,该方由决明子、川芎、赤芍、山楂、丹参、磁石、菊花、葛根等共12种药物组成,具有清肝和血、化瘀通络的作用,因此对于属传统医学血脉病范畴的疾病有一定的治疗作用。既往研究发现该处方可以降低短暂性脑缺血发作(TIA)患者CD41的表达及TIA的复发率,且对于轻度认知功能障碍有一定的改善作用。川芎嗪是该处方中川芎的活性成分,已经广泛的用于脑及心肌缺血的治疗,且具有神经保护作用,其可能的神经保护机制包括抗氧化、抗凋亡、抗炎等作用。因AS属于脉及脉中之血病变继而产生一系列症状,那么清脑通络方对AS时血管吞噬功能是否有作用呢?因此本研究利用ApoE-/-鼠高脂饲喂复制AS模型,探讨清脑通络方对其血管吞噬的作用及其可能的机制。目的：1.观察AS对血管吞噬功能的影响,以及清脑通络方及川芎嗪等对AS时血管吞噬栓子外渗的作用。2.观察清脑通络方及川芎嗪对AS时血脂水平及血和脑组织氧化应激损伤的改善作用。3.鉴于有研究表明紧密连接蛋白Z0-1以及MMP2/9等参与到血管吞噬的过程中且可能对其具有促进作用,观察AS时ZO-1、MMPs、CD31等的变化,以及清脑通络方和川芎嗪对ZO-1、MMP2/9、CD31的作用,对血管吞噬的机制和清脑通络方干预血管吞噬的机制进行探讨。方法：1.动物分组及给药：8-9周的SPF级雄性ApoE基因敲除小鼠(体重18-20g),适应性喂养一周后,给予含脂肪21% (wt/wt)、胆固醇0.15%(wt/wt)的高脂饲料喂养9周后,按照随机数字表法,随机分为4组：AS模型组,清脑通络方组,川芎嗪组,阿托伐他汀组。体重和年龄匹配的雄性C57BL/6小鼠普通饲料喂养9周作为对照组。清脑通络方组(30g/kg/d)及阿托伐他汀组(3mg/kg/d)小鼠分别灌胃给予相应药液,川芎嗪组(12mg/kg/d)小鼠接受腹腔注射川芎嗪干预治疗,连续4周,对照组及模型组小鼠灌胃给予等体积普通饮用水。2.荧光微栓子制备及颈内动脉微栓子注入术：从和ApoE基因敲除小鼠相同遗传背景的C57BL/6小鼠左心室采集动脉血制备直径为8-20μm的血栓栓子,与Texas red-X避光孵育4h以形成荧光共轭。各组小鼠在接受相应干预4周后,均需行颈内动脉荧光微栓子注入术(200μl微栓子悬液)。3.血管吞噬率测定：微栓子注入48h后处死小鼠,处死前15min通过静脉注射番茄凝集素(FITC标记)以标记血管。取脑组织制作脑冰冻切片(50μm),共聚焦显微镜成像以定量栓子的渗出。激发波长分别为488nm和596nm,双通道扫描,发橙红色荧光的是栓子,发绿色荧光的是血管,区别栓子相对于血管的位置,比较各组血管吞噬外渗栓子率。4. Cobas8000生化分析仪定量测定各组血脂水平(包括TC、TG、LDL-C、HDL-C).5.严格按照试剂盒操作说明分别采用WST-1法测定血液和脑组织中SOD活力,TBA法测定血液和脑组织MDA的含量,直接法测血液和脑组织LPO的含量。6.荧光免疫组化法检测脑组织中ZO-1、CD31的蛋白表达。7.免疫印迹法半定量分析脑组织Z0-1、CD31、MMP-2、MMP-9的表达8.明胶酶谱法测定脑组织明胶酶的活性。结果：1.血管吞噬率测定：颈内动脉微栓子注入48h后,脑组织冰冻切片计数血管吞噬率,与C57BL/6对照组相比,ApoE-/-鼠高脂饲喂复制的AS模型血管吞噬栓子外渗率减少,清脑通络方组、川芎组血管吞噬栓子外渗率均高于模型组,差异有统计学意义。2.血脂水平测定：在高脂饲喂13周且给予相应干预4周后,采血检测血脂水平,结果提示AS模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C的水平较对照组升高,而HDL-C水平降低,表明ApoE基因敲除小鼠通过高脂饲喂产生脂代谢紊乱。清脑通络方和阿托伐他汀干预组小鼠的TC、TG、LDL-C水平较模型组降低；川芎组的TG、LDL-C水平较模型组下降。3.SOD活力、MDA和LPO水平测定：和对照组相比,模型组小鼠血液和脑组织中MDA、LPO的含量升高,SOD活力降低。清脑通络方和阿托伐他汀可以减少血及脑组织中MDA、LPO的产生,提高SOD的活力。川芎组MDA的水平较模型组降低,SOD活力升高。4. ZO-1、CD31荧光免疫组化及免疫印迹分析：荧光免疫组化结果提示：和对照组相比,AS模型组Z0-1和CD31的表达减少,而川芎嗪、阿托伐他汀钙和清脑通络方可以不同程度上调ZO-1和CD31的表达。Western Blot分析脑组织ZO-1、CD31表达提示：AS模型组ZO-1和CD31的表达减少,而清脑通络方组和川芎嗪组小鼠脑组织中Z0-1和CD31的蛋白表达较模型组增加。5. MMP-2、MMP-9蛋白表达及明胶酶活性分析：Western-blot分析脑组织MMP-2、MMP-9蛋白表达水平提示：同对照组相比,AS组MMP-2和MMP-9的表达增多,而清脑通络方和川芎嗪可以降低模型组MMP-2和MMP-9的表达。明胶酶谱结果亦提示模型组MMP-9的活性增加,而清脑通络方和川芎嗪可以降低MMP-9的活性。MMP-2的活性在各干预组间差异不明显。结论：1.AS时血管吞噬能力降低,表明动脉粥样硬化是血管吞噬能力的影响因素之一。阿托伐他汀、清脑通络方及川芎嗪干预治疗可以增加栓子外渗率,提高血管吞噬能力。2. ApoE-/-小鼠由于对富含胆固醇的脂蛋白清除障碍,因此高脂喂养13周后表现出以高胆固醇血症为主要特征的脂代谢紊乱。本研究提示清脑通络方和阿托伐他汀干预能够改善AS时血脂代谢紊乱。川芎嗪显示出了一定的调节脂代谢的能力。3.AS时血液及脑组织中产生大量自由基,致使SOD被大量消耗而活力下降,过氧化物质MDA和LPO的生成增多,提示血管内皮细胞的氧化应激损伤。清脑通络方、阿托伐他汀干预治疗可以减轻内皮损伤,提高SOD的活力,降低MDA、LPO的水平；川芎嗪可以提高SOD活力,降低MDA的水平并轻度下调LPO水平。4.AS时ZO-1和CD31蛋白表达降低,内皮细胞紧密连接的屏障功能和BBB的通透性受到破坏,清脑通络方和川芎嗪干预治疗可以上调Z0-1和CD31的表达,保护内皮紧密连接。5.AS时MMP-9和MMP-2的蛋白表达增加,MMP-9的活性增加,对细胞外基质的降解能力增强,而清脑通络方和川芎嗪干预治疗可以降低明胶酶活性,减轻细胞外基质的降解。6.清脑通络方可能通过调节AS血脂代谢紊乱、抗氧化应激、改善BBB的通透性等机制以促进血管吞噬。