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壬基酚(Nonylphenol,NP)是一类工业上大量使用精细化工原料及中间体。由于NP持续不断的环境输入和化学结构的稳定性,其在各类环境介质中的检出普遍性及浓度越来越高,同时各类农作物及市售食品也受到了 NP不同程度的污染。长期接触导致NP在生物体组织中大量富集,甚至在人体血液、乳汁和尿液中也均有较高浓度的检出。作为一种内分泌干扰物,NP已被证实会干扰生殖系统、神经系统及遗传过程,但目前研究多针对于壬基酚高浓度单向的毒性效应研究,缺乏环境相关浓度下的整体性评估,并且NP的综合致毒机理目前尚不完全明确。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)作为一种敏感度极高的环境指示生物,因具有良好的生理结构及清晰的遗传背景,已被广泛的用于化学品的在环境中的毒理评估及机制研究。本研究选用模式生物秀丽隐杆线虫进行壬基酚低浓度下的生殖发育及神经系统的毒性效应评估,并进一步借助高通量测序平台转录组与代谢组进行分子调控机制及代谢方面的毒性机制研究。具体包括以下几个方面:NP环境浓度短期暴露对秀丽隐杆虫生殖发育及脂质贮存等生理过程的毒性效应;NP长期环境浓度暴露对秀丽线虫神经行为学的影响及其分子调控机理;NP暴露对秀丽隐杆线虫整体转录水平及基因调控通路的影响;NP暴露对秀丽隐杆线虫整体代谢小分子水平及代谢通路的影响。研究取得的主要成果如下:(1)环境相关浓度下的壬基酚对秀丽隐杆线虫的暴露可显著性抑制其生长发育,干扰脂质贮存过程以及导致生殖系统异常,引起种群结构及内禀增长率发生变化。在400μgL-1NP暴露条件下,秀丽隐杆线虫的体长、体宽及生长曲线发生显著性变化,通过不同生命阶段L1及L4期暴露结果的比较发现,NP所造成的发育干扰可能出现在秀丽隐杆线虫的发育后期。同时,NP暴露引发了线虫脂滴形态改变及脂质密度贮存程度增加、脂质分布比率增大等现象。此外,NP暴露导致秀丽线虫生殖系统出现剂量依赖性异常增加,其浓度为1 μg L-1条件下即显著影响了线虫的生殖器形态,出现了产卵器畸形、受精卵减少以及首日产卵延迟等负面效应,生殖器的异常与子代数目的减少存在一定联系。在生长发育受到影响的基础上,NP暴露显著性影响了秀丽隐杆线虫的种群组成结构,降低了种群数目和种群的扩繁潜力。(2)NP对秀丽隐杆线虫长期低浓度的暴露(例如10μg L-1)造成了神经行为学损伤,包括头部摆动频率、身体弯曲频率、觅食行为及学习塑性行为等异常生理反应。当NP暴露浓度为10～200μg L-1时,活性氧自由基水平(ROS)显著性提高,并且ROS荧光信号在线虫头部分布尤为明显。抗氧实验结果表明线虫的神经行为学得到了一定程度的恢复。压力应答相关指示基因,包括超氧化物歧化酶(SOD)相关基因(sod-1、sod-3),过氧化氢酶(CTL)相关基因(ctl-2、ctl-3)和细胞色素氧化酶(CYP)相关基因(cyp-35A2)等均出现显著性上调反应,其中通过线虫突变体品系GA186及VC710证实,sod-3基因的过表达对保护机体免受氧化应激损伤起着重要的作用。此外,5-羟色胺合成过程关键限速酶色氨酸羟化酶在ADF和NSM神经元中表达过程受阻,合成及转运过程相关基因(tph-1、cat-1、cat-4、ser-1和mod-5)显著性下调,最终导致5-羟色胺在机体中的浓度水平下降。通过抗氧化剂相关实验验证表明,氧化应激反应和受到干扰的神经递质水平可能是NP神经毒性的主要诱因。(3)研究借助二代Illumina基因测序平台基于秀丽线虫基因数据库共鉴定出127种差异性基因(Fold Change>1.5,FDR<0.05)。根据 Gene Ontology(GO)分析结果,富集到的差异性基因在生物过程(Biological Process)中主要涉及到生长调节及生殖发育调控过程,例如幼虫发育(Nematode larval development)、雌雄同体生殖器发育(Hermaphrodite genitalia development)、生殖过程(Reproduction)、胚胎发育(Embryo development ending in birth or egg hatching)及生长(growth)过程等,其中anc-1、C14C6.5、atp-5和nduf-7等基因的异常表达可能在NP的毒性机制中起重要作用,为前述生长抑制及生殖损伤提供转录水平的机制解释。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析富集到10条与脂质合成代谢相关通路,表明NP暴露所导致的异常脂质贮存发生在基因调控层面,其中stdh-2、gpx-3、K09H11.7、cpt-1、T01B11.2及cysl-2等上下调参与到该过程。根据qRT-PCR实验验证结果,基因相对定量得到的结果趋势与转录组基本一致。(4)为进一步深入探究转录调控下游小分子代谢物的变化,研究借助UPLC-MS技术对秀丽隐杆线虫对照组及400 μg L-1 NP暴露组进行了代谢层面的比较分析。结果共筛选出431种并有效注释出113种差异代谢物。差异代谢产物功能注释及富集分析采用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库及人类代谢组(Human Metabolome Database,HMDB)数据库进行比对,共涉及到脂质代谢过程、氨基酸代谢、糖代谢及多巴胺神经递质代谢等过程。胆碱甘油磷脂(Glycerophosphocholine)和柠檬酸(Citramalic acid)的上调与线虫肠道脂质贮存上调关系紧密。羧酸以及衍生物(Carboxylic acids and derivatives),尤其氨基酸代谢紊乱,通过三羧酸循环(TCA)参与到四大分子的合成代谢过程,对生命活动产生影响。此外,NP暴露引起的儿茶酚胺神经递质的下调在神经行为异常过程中起关键性作用。结合转录组数据分析结果,基因转录调控所引起的代谢物变化为最终生理水平的负面效应提供依据。综上所述,研究发现环境浓度下NP暴露会干扰转录水平及代谢水平的调控稳态,造成秀丽隐杆线虫生长发育、生殖发育及神经系统等损伤,引发机体在个体及种群水平的综合毒性,对生态环境造成潜在威胁。