第一部分大鼠胰腺整体灌注技术的建立研究目的：大鼠胰腺整体灌注是离体研究中准确评价胰岛β细胞功能的一种标准方法，具有稳态、定量、重复性好等优点，目前国内尚未建立该项技术。本研究拟探索开展此项研究的技术方法，为我们下一步的研究工作打下基础。研究方法：6周龄健康雄性Wistar大鼠10只，给予高脂饲料（脂肪产能占总热量的66％）喂养12周后，采用大鼠胰腺移植模型供体手术操作步骤分离大鼠胰腺组织。分离的大鼠胰腺组织包括胰腺、十二指肠、腹腔干和肠系膜上动脉所在的腹主动脉段、门静脉、腹主动脉插管及门静脉插管。体外胰腺整体灌注的灌注液采用Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液，基本成分如下：NaCl，118 mM；KCl，4 mM；CaCl₂，2.5 mM；MgSO₄，1.2mM；KH₂PO₄，1.2 mM；NaHCO₃，25 mM；牛血清白蛋白，1.25 g／L；右旋糖苷T70，40 g／L。在Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液中分别加入5.6mM葡萄糖及16.7 mM葡萄糖，在含5.6 mM葡萄糖的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液中加入19 mM精氨酸，即制成分别含5.6 mM葡萄糖、16.7mM葡萄糖及19 mM精氨酸的Krebs-Ringer缓冲液。调节终PH值至7.4。灌注液由可控制流速的多通道蠕动泵泵出，顺次通过腹主动脉插管、胰腺组织及门静脉插管，在门静脉插管出口处收集流出液。体外胰腺整体灌注过程为：灌注开始前1小时和整个灌注期间，灌注液和浸浴大鼠胰腺组织的孵育液中持续输入含95％O₂和5％CO₂混合气体，并保持37℃恒温；基础Krebs-Ringer缓冲液灌注20分钟；继之依次灌注含5.6 mM葡萄糖灌注液10分钟、含16.7 mM葡萄糖灌注液20分钟、含5.6 mM葡萄糖灌注液10分钟及含19 mM精氨酸灌注液20分钟；收集每分钟流出液，贮存于-20℃冰箱，待统一检测胰岛素水平；灌注期间灌注液流速保持在3ml／min，灌注压保持在60-80mmHg，灌注结束后检测十二指肠蠕动活性。研究结果：本研究的10只大鼠中有6只大鼠成功完成了离体胰腺整体灌注：①在整个灌注期间灌注压保持在70.17±5.04mmHg；②灌注结束后检测分离的胰腺十二指肠组织块，均存在十二指肠蠕动活性；③持续精氨酸刺激较持续高糖刺激胰岛素分泌幅度明显增高（最大胰岛素分泌率：987.47±99.50μU／分比545.41±50.00μU／分，P＜0.05；平均胰岛素分泌率：543.92±72.75μU／分比259.99±27.90μU／分，P＜0.05）。符合离体胰腺完整性的评定标准。研究结论：本研究成功建立了大鼠胰腺整体灌注技术，可用于大鼠离体胰岛β细胞功能研究。第二部分糖脂协同毒性对胰岛β细胞胰岛素分泌功能影响的活体及离体研究研究目的：我们的前期研究工作发现，以自发性酮症起病的肥胖糖尿病患者以高游离脂肪酸（FFA）血症及高血糖为突出特征，伴随严重的外周胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能衰竭。结合近年来日益受到关注的糖脂协同毒性（glucolipotoxicity）学说，我们推测，此类患者体内同时存在的严重高FFA血症及高血糖可能是其胰岛β细胞功能衰竭的重要原因。本研究通过外源性升高高脂肥胖大鼠循环中葡萄糖和FFA水平，观察高血糖与高FFA血症协同作用（糖脂毒性）对胰岛β细胞功能与酮体生成的影响，探讨以自发性酮症起病的肥胖糖尿病患者胰岛β细胞功能衰竭的病理生理机制。研究方法：将34只高脂肥胖雄性Wistar大鼠随机分为3组。对照组（NS组）11只经颈静脉插管输入生理盐水；高游离脂肪酸组（FFA组）11只输入脂肪乳+肝素以维持血FFA水平在1000-2000μmol／L；高糖高游离脂肪酸组（GS-FFA组）12只输入葡萄糖液及脂肪乳+肝素以维持血FFA及血糖水平分别在1000-2000μmol／L与15-20mmol／L。输注持续时间48小时。所有3组动物于输液前均经颈动脉采血测定血FFA、β-羟丁酸（β-HBA）、血糖、胰岛素水平，于输液结束时经颈动脉采血测定血FFA、β-HBA及血糖水平。所有3组动物于输液结束后均随机分为A、B2组，每组动物5-6只。A组：采用静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT）评价胰岛β细胞分泌功能。B组：采用体外胰腺整体灌注技术评价胰岛β细胞分泌功能。研究结果：（1）3组动物基础状态下血浆β-HBA水平基本一致（NS组：0.220±0.049 mmol／L；FFA组：0.201±0.055 mmol／L，GS-FFA组：0.218±0.051 mmol／L，P＞0.05）。（2）静脉输液结束时NS组与FFA组血β-HBA水平较基础值轻度升高（NS组：0.491±0.161 mmol／L、FFA组：0.727±0.130 mmol／L），而GS-FFA组血β-HBA水平较基础值显著增高（1.476±0.334mmol／L），GS-FFA组与FFA组、NS组比较，P＜0.05；FFA组与NS组比较，P＞0.05。（3）GS-FFA组IVGTT中葡萄糖刺激的胰岛素分泌较NS组与FFA组显著降低（GS-FFA组与FFA组、NS组比较，P＜0.05；FFA组与NS组比较，P＞0.05）。（4）3组动物体外胰腺整体灌注过程中平均基础胰岛素分泌率无明显差别（NS组：123.37±52.90uU／min；FFA组：122.26±45.93 uU／min；GS-FFA组：106.72±39.64uU／min，P＞0.05）。给予16.7 mM葡萄糖刺激后，GS-FFA组的平均胰岛素分泌率较NS组与FFA组显著降低（NS组：386.67±64.80 uU／min；FFA组：356.41±47.06 uU／min；GS-FFA组：158.27±48.08 uU／min，GS-FFA组与FFA组、NS组比较，P＜0.05；FFA组与NS组比较，P＞0.05）。给予19 mM精氨酸刺激后，GS-FFA组平均胰岛素分泌率亦较NS组与FFA组显著降低（NS组：601.12±106.18 uU／min；FFA组：548.47±64.26 uU／min，；GS-FFA组：233.14±61.58 uU／min，GS-FFA组与FFA组、NS组比较，P＜0.05；FFA组与NS组比较，P＞0.05）。研究结论：外源性升高高脂肥胖大鼠血糖和血FFA水平可严重损害高脂肥胖大鼠胰岛β细胞的胰岛素分泌功能，导致酮体生成显著增加，提示以自发性酮症起病的肥胖糖尿病患者胰岛β细胞功能衰竭的病理生理机制可能与其同时存在的严重高血糖与高FFA血症有关。第三部分细胞凋亡和线粒体凋亡途径在糖脂毒性导致高脂肥胖大鼠胰岛β细胞功能障碍中的作用研究目的：糖脂毒性诱导的胰岛β细胞凋亡是T2DM进行性胰岛β细胞功能衰退的重要原因，而线粒体凋亡途径可能在糖脂毒性诱导胰岛β细胞凋亡的过程中起着关键作用。本研究以胰岛β细胞凋亡和线粒体凋亡途径为切入点，探讨糖脂毒性引起高脂肥胖大鼠胰岛β细胞功能障碍的可能机制。研究方法：6周龄健康雄性Wistar大鼠18只，给予高脂饲料（脂肪产能占总热量的66％）喂养12周后，将其随机分为3组。对照组（NS组）6只经颈静脉插管输入生理盐水；高游离脂肪酸组（FFA组）6只输入脂肪乳+肝素以维持血FFA水平在1000-2000μmol／L；高糖高游离脂肪酸组（GS-FFA组）6只输入葡萄糖液及脂肪乳+肝素以维持血FFA及血糖水平分别在1000-2000μmol／L与15-20mmol／L。输注持续时间48小时。所有3组动物于输液前均经颈动脉采血测定血FFA、β-羟丁酸（β-HBA）、血糖、胰岛素水平，于输液结束时经颈动脉采血测定血FFA、β-HBA、血糖水平。输液结束后，采用IVGTT评价3组动物胰岛β细胞分泌功能。IVGTT后处死动物，留取胰尾组织，置于10％中性缓冲福尔马林溶液中固定24小时，石蜡包埋，采用TUNEL技术检测胰岛细胞凋亡水平，采用免疫组织化学技术测定胰岛细胞Cyt C、AIF、caspase-9和caspase-3表达水平。同时留取胰尾组织电镜标本以备观察胰岛β细胞线粒体结构变化。研究结果：（1）3组动物血β-HBA及IVGTT结果见前述（第二部分）。（2）3组动物静脉输液结束后，胰岛细胞凋亡TUNEL检测显示：胰岛细胞凋亡比例分别为NS组：12.9±4.2％、FFA组：14.8±3.7％和GS-FFA组：22.7±8.6％。其中GS-FFA组胰岛细胞凋亡比例显著增加，差异有显著性（GS-FFA组与FFA组、NS组比较，P＜0.05；FFA组与NS组比较，P＞0.05）；胰岛β细胞透射电子显微镜成像发现，GS-FFA组胰岛β细胞线粒体基质明显肿胀、嵴断裂，同时胰岛β细胞核染色质致密化，形成形状不一、大小不等的团块边集于核膜处，FFA组与NS组胰岛β细胞线粒体基质肿胀、嵴断裂较GS-FFA组轻，核染色质均匀；胰岛细胞免疫组化结果显示：Cyt C、AIF、Caspase-9及Caspase-3表达水平在GS-FFA组显著增高（GS-FFA组与FFA组、NS组比较，P＜0.05；FFA组与NS组比较，P＞0.05）。研究结论：糖脂毒性严重损害高脂肥胖大鼠胰岛素分泌功能的机制与其胰岛β细胞凋亡显著增加有关。糖脂毒性诱导CytC和AIF自线粒体向细胞质释放，依次激活caspase-9和caspase-3，启动细胞凋亡的线粒体途径。细胞凋亡的线粒体途径在糖脂毒性诱导高脂肥胖大鼠胰岛β细胞凋亡的过程中具有重要作用。