论文部分内容阅读
维生素C又名抗坏血酸(L-ascorbic acid，AsA)，是动植物体内一种重要的抗氧化剂。在植物体内，维生素C不仅在光合作用和光保护中起重要作用，而且还参与了细胞的分裂、抗逆和信号转导等一系列重要的生理过程。人类由于缺乏维生素C合成途径中的最后一个酶，自身不能合成维生素C，必须每天从膳食中获取足够的维生素C，所以植物成了人们摄取维生素C的一个最重要的来源。尽管动物体内维生素C的合成已经研究的很清楚，但是关于维生素C在植物体内的合成途径一直到最近才逐渐被人们所认识。到目前为止，已经证明在植物体内至少存在两条维生素C合成途径，Mannose/L-galactose途径和L-GalUA途径。最近有证据表明myo-inositol也可以作为一种碳源参与维生素C的合成。
本论文主要研究植物维生素C合成途径(Mannose/L-galactose途径)上的两个酶(phosphomannomutase和L-galactose-1-phosphate phosphatase)，分别从生化和遗传学的水平上分析这两个酶在维生素C合成中的作用。
磷酸甘露糖变位酶(phosphomannomutase，简称PMM)属于一类新型的磷酸转移酶，主要催化mannose-6-phosphate和mannose-1-phosphate之间的转化。在哺乳动物和真菌中这个酶的功能已经研究的比较清楚，但是在高等植物中关于这个酶的系统的生化和分子生物学分析到目前还没有报道。在本研究中，我们首次分别从拟南芥、烟草、大豆、番茄、水稻和普通小麦中分离了PMM的全长cDNA。植物的PMM和来自哺乳动物和真菌的PMM在氨基酸序列上非常相似(相似性都在50％以上)，都含有非常保守的结构域(DVDGT)。除了在一级结构上相似外，植物的PMM还可以互补酵母温度敏感型的突变体sec53-6。以拟南芥的PMM为例，分别用洋葱表皮细胞、昆虫细胞体系及western blotting的方法证明了AtPMM定位在细胞质中。为了更好的研究PMM的生化功能，我们在E.coli中表达和纯化了AtPMM的融合蛋白，并详细分析了AtPMM融合蛋白的生化特征。我们发现和人类的PMM一样，AtPMM也需要glucose-1,6-bisphosphate(或mannose-1,6-bisphosphate)作为辅助因子。AtPMM除了具有磷酸甘露糖变位酶的活性外，还具有磷酸葡萄糖变位酶的活性，但对前者的催化效率更高，大概是后者的十倍左右。AtPMM的最适温度和最适pH值和人类PMM1差不多，分别在30℃和pH7.5附近。在拟南芥和烟草中，PMM在各个器官都表达，且在表达量上没有明显的差异。通过病毒诱导的基因沉默研究(Virus induced gene silencing，VIGS)发现在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中PMM基因的减量表达可以显著降低叶片中维生素C的含量；同时用病毒载体介导的过量表达AtPMM则可以提高叶片中维生素C的含量。与这个结果一致的是在拟南芥中过量表达AtPMM-GFP融合蛋白也可以显著提高叶片中维生素C的含量。总之，我们的试验为PMM参与高等植物中维生素C的生物合成提供了分子生物学依据。
L-galactose-1-phosphate phosphatase(GPP)这个酶直到最近才被人们从猕猴桃中纯化。通过生物信息学的分析，在番茄中有三个基因编码这个酶(LeGPP)。以前的研究认为这个基因家族主要的功能是编码myo-Inositol monophosphatase(IMP)，在肌醇的合成和代谢中起主要作用。在本研究中，我们从番茄中克隆了三个LeGPP的全长cDNA。通过序列比较发现，LeGPP和来自猕猴桃(AAV49506)及拟南芥(At3g02870)的GPP在氨基酸序列上非常相似(相似性都在70％以上)，而且都含有非常保守的功能域。为了研究这三个基因在维生素C合成过程中的作用，我们通过原核表达系统分别表达和纯化了这三个蛋白，对其生化特征进行了详细的研究。结果表明这三个蛋白都主要具有GPP酶活性，能催化L-gal-1-P转化为L-gal。同时这三个蛋白的GPP酶活性是镁离子依赖的，锂离子对这三个酶有很强的抑制作用。LeGPP的活性还受到不同浓度AsA的抑制，揭示这个酶在维生素C合成和调控中起着非常重要的作用。除了相似性外，三个LeGPP蛋白之间也有区别。从生化特征上看，LeGPP2和LeGPP3蛋白的功能更接近。我们还在拟南芥中过量表达了LeGPP1和LeGPP3这两个蛋白，但从目前的研究来看，过量表达株系和野生型之间在表型上没有显著的差异，测维生素C含量也没有明显的区别。很有可能是维生素C的合成存在负反馈抑制，或这个酶在整个合成途径中并、是一个限速酶。我们还将利用VIGS系统，在番茄中分别减少这三个基因的表达，从而更好的研究这三个酶的生理功能，尤其是在维生素C合成中的作用。