肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,是我国位居第二的癌症“杀手”,全国每年至少有12万人被肝癌夺去生命。现有的治疗方法临床疗效不甚理想,研究开发抗肝癌的药物是我国面临的重要抗癌任务。近年来抗肿瘤药物的研究方向已由单一的细胞毒类药物向多元化方向发展,尤其越来越多的证据表明细胞增殖、分化、凋亡三者之间的平衡失调与肿瘤的发生、发展有关,多种肿瘤存在细胞凋亡受阻现象。因此,如果对细胞凋亡的机制进行深入研究,寻找能够启动细胞凋亡的高效特异抗肿瘤药物,将为包括肝癌在内的肿瘤的治疗提供一个新的策略。自20世纪70年代初哈尔滨医科大学第一附属医院开始尝试用砷剂(亚砷酸钠)治疗急性早幼粒白血病取得了很好的疗效以来,砷剂的抗肿瘤作用越来越受到人们的关注,展开了世界范围内的大量相关系列的研究;同时近年来也有报道显示丹皮酚较高浓度时在体内、外实验中均有抗肿瘤作用,并诱导肿瘤细胞凋亡、影响凋亡相关基因表达。我们从有机胂的角度出发,结合丹皮酚的抗炎、活血和抗肿瘤等特性,通过丹皮酚与对氨基苯胂酸(阿散酸)进行偶联反应,合成了未见前人报道的丹皮酚的偶氮化合物2-甲氧基-4-羟基-5-乙酰基偶氮苯-4’-胂酸(用符号R2表示),并进行了HepG2细胞生长抑制实验、诱导HepG2细胞凋亡分析及机制探讨,旨在探索一种结构简单、较低浓度下就可以诱导体外及体内肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞影响较小的新型有机胂药物。本文的主要研究方法、内容及结论如下:1.用MTT法测定2-甲氧基-4-羟基-5-乙酰基偶氮苯-4’-胂酸(R2)对HepG2细胞生长抑制的情况。结果显示对氨基苯胂酸和丹皮酚的偶氮化合物2-甲氧基-4-羟基-5-乙酰基偶氮苯-4’-胂酸(R2)对人肝癌细胞HepG2的生长有明显的抑制作用,其抑制作用具有时间、浓度依赖性,在最初24h和较大浓度时抑制效果最好。2.在细胞形态学检测中采用了普通倒置相差显微镜观察、HE染色、透射电镜、荧光显微镜观察,均发现丹皮酚胂化物R2在浓度为5×10-7和10-6mol.L-1时有诱导HepG2肝癌细胞凋亡的现象。3.应用流式细胞仪结合荧光染料对实验细胞作了进一步的形态学和生化分析。PI单染结果显示有凋亡现象,G0/G1期细胞所占百分比明显下降,而S期细胞比例明显增加。Annexin-V/PI双染结果R2诱导细胞的凋亡率远大于细胞坏死率。Rhodamine 123染色结果显示R2作用后HepG2细胞线粒体跨膜电位下降,且呈时间、剂量依赖性。 4.琼脂糖凝胶电泳结果显示R2作用24h后的实验组细胞产生了DNA梯状条<WP=6>带。5.HepG2细胞凋亡相关蛋白分析的实验中采用了免疫组化染色法,结果显示HepG2细胞Bcl-2基因的表达减低,有明显的浓度依赖性。p53表达水平也下降,且较Bcl-2显著。 6.HepG2细胞凋亡的酶学分析实验中采用了比色法,结果显示R2诱导HepG2细胞凋亡过程中三种Caspase蛋白酶活性均呈时间依赖性和浓度依赖性增高,其中以Caspase-9和Caspase-3蛋白酶活性升高显著,Caspase-8活性仅轻度增高。7.动物急性毒理试验求得R2的半致死剂量为580.12mg/kg,表明丹皮酚胂化物R2有毒性,但其急性毒性较小。