葡萄VvNAC08和VvNAC17转录因子在响应干旱胁迫中的功能研究

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wolaile999
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葡萄(Vitis)因其具有重要的经济价值和营养价值,在世界范围内被广泛栽培种植。干旱和半干旱地区是酿酒葡萄栽培的优质产区和主产区,如美国加州、中国西北、南澳大利亚、南地中海等地区,这些产区降雨量少、日照充足,为酿酒葡萄生长提供了得天独厚的生态条件。但随着全球气候变暖,高温、干旱已成为葡萄与葡萄酒产业可持续发展的主要制约因素之一,越来越多的研究者关注葡萄应对干旱胁迫的响应机制。研究发现转录因子(如WRKY、NAC、MYB、b HLH等)在植物响应干旱胁迫过程中起到重要作用,而葡萄NAC(NAM,ATAF,CUC)转录因子在干旱胁迫中的响应机制尚不明确。本研究以欧亚种酿酒葡萄赤霞珠(Vitis Vinifera L.Carbernet Sauvignon)为试材,处理组进行自然干旱处理,处理期间不灌水;对照组正常灌水,利用称重法补充所需水分。利用生理生化和转录组测序相结合的研究手段,探究葡萄对干旱胁迫的响应机理;同时,筛选并克隆VvNAC08和VvNAC17基因,利用转基因技术在拟南芥中过表达VvNAC08和VvNAC17基因,分析葡萄NAC转录因子在干旱胁迫响应过程中的功能,为丰富葡萄NAC转录因子家族功能和葡萄分子育种提供理论基础。主要研究结果如下:(1)结合生理生化和转录组测序技术分析葡萄幼苗对干旱胁迫的响应机制。葡萄植株通过调节光合作用强度、气孔开张度、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)的酶活性及过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2)含量响应干旱胁迫;同时,叶片中脯氨酸(Proline,Pro)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)在葡萄响应干旱方面也有重要作用。葡萄叶片中C6和C9类物质,尤其是(E)-2-己烯醛和3-己烯醛的含量在干旱胁迫后显著增加,表明这些物质可能在葡萄植株响应干旱胁迫过程中起到重要作用。转录组数据分析表明,干旱胁迫后葡萄植株中共有1286个基因差异表达,这些基因主要参与的生物学途径包括:光合作用、叶绿素代谢和次生代谢物合成等;干旱胁迫后,葡萄植株中表达量(|log2Fold Change|≥1)上调的VvNAC基因共有13个,下调的有2个,占所有差异表达转录因子基因的7%,仅次于MYB(16%)和AP2-ERE-BP(11%),表明葡萄VvNAC转录因子可能参与干旱胁迫的响应。(2)分析鉴定出两个葡萄VvNAC转录因子:VvNAC08和VvNAC17。进化树分析表明,葡萄VvNAC转录因子家族共分为5个亚族,其中与逆境胁迫相关的家族成员主要分布在第Ⅴ亚族;结合转录组数据和生物信息学分析初步筛选出8个可能与逆境胁迫相关的葡萄VvNAC转录因子家族成员,表达分析发现,葡萄VvNAC基因在根、茎、幼叶、老叶、卷须、花和果实中有不同程度的差异表达;干旱、极端温度(4℃、45℃)、外源激素(脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、褪黑素(MT)、茉莉酸(JA))可以诱导或抑制VvNACs基因的表达,尤其是VvNAC08、VvNAC17和VvNAC26可以被多数处理显著诱导表达。综合转录组数据、生物信息学及表达模式分析,本研究分析鉴定出葡萄NAC转录因子家族中可能参与干旱胁迫的VvNAC08和VvNAC17进行功能验证。(3)通过拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析发现VvNAC08和VvNAC17均定位在细胞核中。在酵母中进行转录激活活性验证,结果表明VvNAC08和VvNAC17均具有转录激活活性,且VvNAC08转录激活区域在C端第229到263氨基酸之间;VvNAC17转录激活区域在C端第218到272氨基酸之间。酵母单杂交结果表明VvNAC08和VvNAC17转录因子可以特异性的结合NACRs(CGTA/CGTG)核心响应元件。(4)在拟南芥中过表达VvNAC08和VvNAC17基因进行功能验证。结果表明,甘露醇和盐胁迫下VvNAC08和VvNAC17过表达植株的种子萌芽率和根长都显著高于野生型植株;冷胁迫后VvNAC08和VvNAC17转基因植株有较高的存活率;外源ABA处理后,VvNAC08和VvNAC17转基因植株的种子萌芽率、根长、叶片气孔开张度和气孔密度显著低于野生型;离体叶片自然脱水处理后,VvNAC08和VvNAC17过表达植株的叶片失水率、气孔开张度和气孔密度显著降低;自然干旱处理后,VvNAC08和VvNAC17过表达植株的存活率、抗氧化酶(POD、SOD、CAT)活性、脯氨酸和内源ABA含量显著高于野生型,MDA和H2O2含量显著低于野生型;外源ABA和干旱处理后,VvNAC08和VvNAC17过表达植株中ABA信号途径和逆境相关基因(如:ABI5、AREB1、COR15A、COR47、P5CS、RD22、RD29A)的表达量显著高于野生型植株。综上所述,VvNAC08和VvNAC17基因明显增强了转基因拟南芥的抗旱能力。
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