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目的:本研究利用慢性牙周炎患者口腔中采集的龈下菌斑,在实验室环境下分离培养牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis）临床株,并使用微阵列比较基因组杂交（array-based Comparative Genomic Hybridization,array-CGH）技术分析P. gingivalis临床株与低毒力标准株ATCC 33277在全基因组水平上的遗传学差异,分析差异基因与细菌致病能力之间关系,定位高度可疑毒力基因。为今后使用基因芯片技术寻找P.gingivalis致病基因,临床大范围筛查感染高毒力克隆株的高危人群,以及牙周炎基因疫苗靶位点选择提供帮助,最终为疾病的预防和诊治提供指导。方法:1.研究对象选择:选择慢性牙周炎患者45例,排除其他全身系统性疾病,过去六个月内未曾服用抗生素或接受牙周系统性治疗者,无吸烟史,排除妊娠期及哺乳期妇女,知情同意。每位志愿者选择病变最严重部位以及健康或存在轻度龈炎部位纳入研究,记录采样部位各项牙周指标,所有检查及指标观察均由同一检查者完成。2.标本采集与细菌培养鉴定:收集采样位点龈下菌斑置于转送液中,稀释后接种于牛脑心浸出液（Brain Heart Infusion, BHI）培养基上厌氧培养,经分离、次代纯化培养、固体增菌后收集菌体待用。使用试剂盒提取DNA,采用P.gingivalis特异性引物进行聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）,记录出现阳性条带样本,经测序比对进一步确认。3.微阵列基因芯片:使用前期实验中自主设计构建的全基因组规模的array-CGH芯片平台,覆盖美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）上公布的 12 株P.gingivalis 菌的基因组序列信息。4.芯片杂交:利用array-CGH技术对P.gingivalis临床分离株与低毒力标准株P.gingivalis ATCC 33277基因组进行比较杂交。以ATCC 33277自身杂交为阴性对照,以高毒力株P. gingivalis W83与ATCC 33277杂交为阳性对照。基因组DNA经酶切,荧光标记及纯化后,1:1混合与芯片上探针竞争杂交。5.结果分析及PCR验证:扫描芯片获得探针信号,所得差异基因利用基本局部比对搜索工具（Basic Local Aligment Search Tool,BLAST）进行同源比对,利用PCR反应对芯片结果进一步验证。6.差异基因分析:P.gingivalis菌株间进行同源性分析并绘制系统发育树状图,进一步分析所得差异基因的功能以及与细菌毒力强弱之间关系。结果:1.本研究从45名慢性牙周炎患者的90个龈下菌斑样品中成功分离出142个特征性黑色菌落。2.经PCR特异性扩增及测序比对确认,共成功分离出10株P.gingivalis单克隆株,其中9株培养成功。健康及轻度牙龈炎位点仅分离出1株临床株,其余8株采样位点均为牙周炎严重病变位点。为丰富基因多样性,从同一采样位点分离的临床株仅挑取一株进行后续实验,因此选取6株P.gingivalis临床株进行后续实验。3.基因组DNA与基因芯片上探针竞争结合,扫描后获得荧光信号,与自身杂交的标准株ATCC 33277为均一的黄色信号,而6株临床株与ATCC 33277杂交呈现强弱不等的红绿混杂信号,不同菌株杂交结果不一,提示P.gingivalis不同菌株基因组DNA存在基因多样性和异质性。4.临床株与高毒力株同源性较高,轻度龈炎位点与牙周炎重度病变位点分离的P.gingivalis菌株无显著基因差异。5.利用array-CGH技术比较临床株与低毒力株ATCC 33277全基因组DNA,发现多处基因拷贝数差异,其中包括一段长度约34.5kb的连续差异片段PGN0060到PGN0095,为ATCC 33277特有的转座接合子CTnPgl-a中的一部分,与细菌基因水平转移功能密切相关。另外,4株以上临床株拷贝数增加的102个基因均为高毒力株W83与TDC60基因组特有,其中包括两个连续基因片段 PG1473 到 PG1490 和 PGTDC60RS04345 到 PGTDC60RS04405,长度分别是15.7kb和17.4kb,所包含的基因大部分与细菌转座结合功能相关。两个片段的结构及组成与致病岛（Pathogenicity Islands,PAIs）特征吻合,可能为P.gingivalis毒力基因位点。6.差异基因经BLAST进行同源性比对,利用PCR进一步验证,结果与芯片结果一致,证明array-CGH技术结果可靠。结论:array-CGH技术能用于研究P.gingivalis毒力基因的研究,定位的多个可疑位点为阐释P.gingivalis致病机制,以及研究牙周炎基因疫苗有效靶位点的选择提供理论指导。