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丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科（Labiatae）鼠尾草属（Salvia）多年生草本植物,传统中药以其干燥根茎入药,具有活血化瘀、养血安神等功效。丹参酮类化合物（Tanshinone）是丹参中重要的药用活性成分之一。植物细胞色素P450（Cytochrome P450,CYP450）是广泛存在于植物体内的一类酶蛋白超家族,在植物代谢过程中发挥着重要的作用。近年来,发掘CYP450基因功能已成为了解丹参酮类化合物合成下游途径的研究热点,多项研究聚焦于丹参中CYP450基因参与丹参酮生物合成的方式和途径。本课题结合以往的报道,以丹参全基因组数据库为基础,检索并鉴定获得了 116条丹参CYP450超家族全长基因。通过生物信息学软件分析丹参CYP450超家族成员的理化性质和系统进化关系,将研究范围锁定至丹参CYP76家族;对比不同类型基因的保守基序,分析SmCYP76家族成员的基因结构和9条SmCYP76基因在不同部位及不同激素处理下的表达模式,筛选出了两条SmCYP450基因SmCYP76AK2和SmCYP76AK3,推测其有可能参与了丹参酮类化合物的合成。随后,通过构建两个基因的过表达和敲除载体,利用农杆菌浸染丹参叶片获得转基因株系,验证了目的基因对丹参酮类化合物合成的影响。同时构建目的基因的原核表达载体,诱导并纯化得到目的蛋白,为在体外深入探求两条基因的功能提供了参考。主要研究方法及结果如下:1.参与丹参酮合成目的基因的筛选基于文献查阅和生物信息学分析鉴定获得了 1 16条SmCYP450s全长基因,使用邻接法分别对A-type和non-A-type基因构建系统进化树,发现有67个SmCYP450s（57.8%）属于A-type,归属于17个家族;其余49条基因（42.2%）属于non-A-type,归属于31个家族。利用生物信息学软件对所有成员进行理化性质和保守基序分析,发现不同类型SmCYP450的保守基序有所不同。其中,SmCYP76家族已有3条基因被证实参与丹参酮类化合物合成,且所有SmCYP76基因序列高度保守,存在特有的基序motif 15,推测可能还存在与此相关的SmCYP76。结合该家族成员不同组织部位、不同非生物胁迫的表达模式和响应情况,进一步筛选出了两条可能参与丹参酮类化合物合成和积累的基因SmCYP76AK2和SmCYP76AK3,这两条基因主要在根中表达,并显著响应茉莉酸甲酯和水杨酸等非生物胁迫。2.SmCYP76AK2和SmCYP76AK3转基因株系的获取克隆两条丹参CYP450酶基因SmCYP76AK2和SmCYP76AK3（以下简称SmCYP76AK2/3）,两条基因的 cDNA 全长分别为 1548 bp（SmCYP76AK2）和 1638 bp（SmCYP76AK3）,分别编码495和491个氨基酸。借助Gateway技术和CRISPR/Cas9技术构建了SmCYP76AK2/3过表达和敲除载体,利用农杆菌介导的叶盘转化法获得了SmCYP76AK2和SmCYP76AK3的过表达和敲除株系,包括3个SmCYP76AK2 过表达株系（OE-AK2-1,OE-AK2-2,OE-AK2-4）,7个SmCYP76AK3过表达株系（OE-AK3-1,OE-AK3-2～OE-AK3-7）,8个SmCYP76AK2基因敲除株系（CH-AK2-1,CH-AK2-2,CH-AK2-4,CH-AK2-6～CH-AK2-10）和 14 个SmCYP76AK3基因敲除株系（CH-AK3-2～CH-AK3-4,CH-AK3-6～CH-AK3-13,CH-AK3-16,CH-AK3-18,CH-AK3-20）。3.SmCYP76AK2和SmCYP76AK3基因对丹参酮类化合物合成的影响利用LC-MS测定了转基因过表达和敲除植株中丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、二氢丹参酮和丹参酮ⅡB的含量,结果显示,与对照组相比,SmCYP76AK2过表达植株中丹参酮Ⅰ的含量提高5.49、4.91和4.28倍;隐丹参酮含量提高了 27.76、16.67和25.88倍;丹参酮ⅡB含量提高了 23.21、4.07和4.96倍;二氢丹参酮含量提高了 36.85、28.74和10.50倍;丹参酮ⅡA的含量提高了 44.58、16.67和25.88倍。SmCYP76AK2和SmCYP76AK3的基因敲除植株中各丹参酮类化合物的含量则相对降低超过90%,表明SmCYP76AK2和SmCYP76AK3参与了丹参酮类化合物的合成。4.SmCYP76AK2和SmCYP76AK3蛋白的体外纯化构建SrnCYP76AK2和SmCYP76AK3蛋白原核表达载体,成功诱导表达并纯化出目的蛋白。通过对原核表达载体的诱导表达和对蛋白的纯化,证明SmCYP76AK2和SmCYP76AK3蛋白为可溶性蛋白,诱导温度为16℃时两种蛋白均大量组装,且会产生少量包涵体。综上所述,本研究在探索丹参CYP450超家族系统进化及分类的基础上,对不同组织部位、不同非生物胁迫下基因的表达模式和响应情况进行分析,发现SmCYP76AK2和SmCYP76AK3可能参与了丹参酮类化合物的合成,进一步通过对转基因过表达和敲除株系的研究,证实SmCYP76AK2和SmCYP76AK3参与了丹参酮类化合物的合成,为深入探究丹参CYP450基因调控丹参酮类化合物合成的分子机制提供了参考。