脑缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)是指在某些情况下脑组织缺血后血流再通,导致进一步的组织损伤和功能障碍,这是一个多种因素参与的复杂病理生理过程。脑IRI可引起广泛的微血管功能障碍和组织屏障功能的改变,再灌注损伤后引起的炎症反应可引起全身炎症反应或多器官功能障碍综合症,占重症死亡率的30-40%。目前尚无针对脑IRI的特效治疗方案,因此,急需通过探讨脑IRI的机制,寻找新的预防和治疗脑IRI的方法。microRNAs(miRNAs)是重要的转录后调节分子,可通过与多个靶信使RNA(mRNA)结合,调节靶基因的表达。microRNA-708(miR-708)是最近发现的miRNA,其功能尚未明确,目前已知的功能多与肿瘤的进展相关,其已知的靶基因包括 cyclin2B,survivin,Raplb,neuronatin 和 AKT2。除了在肿瘤中的作用,还发现在气管平滑肌细胞中miR-708通过下调JNK/MAP和PTEN/AKT信号通路降低细胞表面蛋白CD38的表达。最近在大鼠大脑中动脉缺血模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)中发现,与对照组相比,miR-708 在脑 IRI 后24小时和72小时表达降低,为对照的50%左右。Jaunus kinases(JAK)是细胞质酪氨酸激酶,介导多个细胞因子信号通路进而主要在造血和免疫应答中影响细胞生长,分化和生存。已有研究发现JAK/STAT信号通路参与脑IRI。在对大鼠造成脑缺血后出现包括JAK1和STAT3蛋白的JAK/STAT信号通路激活,STAT3在脑缺血再灌注24小时后的神经元细胞中发生磷酸化。此外,在C57BL/6小鼠的脑IRI模型中发现,在IRI后24小时磷酸化JAK1和磷酸化STAT1的表达显著升高。在用黄芪甲苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1或三七皂苷R1单独治疗或联合治疗的IRI小鼠大脑中,磷酸化JAKI和磷酸化STAT1的表达则显著下降,说明JAK1和STAT1参与小鼠IRI过程。在本文中,我们将深入探讨miR-708在脑IRI中的作用及其作用靶点和作用机制,为开发出新的缺血性脑损伤治疗靶点奠定理论基础。第一部分miR-708在大鼠脑缺血再灌注中的表达目的:观察大鼠MCAO模型中miR-708的表达,初步探讨miR-708的表达与缺血再灌注损伤的关系。方法:取25只成年SD大鼠,随机抽取10只仅做股动脉分离,设为对照组,其余大鼠采用经典的线栓法制备大鼠MCAO模型,缺血90 min后将线栓拔出,缝合伤口,将术后存活的10只SD大鼠设为实验组。再灌注24小时后,麻醉2组小鼠,通过眼眶取血(每只500μl),并用PBS通过心脏灌注后取脑梗死核心区组织。一部分组织用于切片,一部分组织用于提取RNA。用于切片的组织每隔2 mm切一片,将切片置于TTC染液中染色后拍照,计算梗死体积。用于提取RNA的组织,利用Trizol提取RNA后反转录为cDNA,real-time PCR检测miR-708的表达。采集的大鼠全血通过试剂盒分离提取外周血mRNA,利用real-time PCR检测miR-708的表达水平。结果:1.TTC染色结果显示,对照组大鼠脑皮层下白质的染色呈现红色,而实验组大鼠脑皮层下白质的TTC染色则呈现灰白色,表明皮层下梗死,说明造模成功。2.与对照组相比,外周血及脑组织中实验组miR-708的mRNA表达显著降低,说明miR-708的表达在脑IRI中降低。结论:脑IRI的大鼠外周血及脑组织中miR-708表达降低。第二部分miR-708在体外细胞缺血再灌注模型中的作用目的:利用氧糖剥夺和复氧(Oxygen and glucose deprivation and reoxygenation,OGD/R)建立体外脑IRI模型阐明miR-708在脑IRI中的作用,包括对OGD/R细胞的增殖,凋亡,细胞周期分布,迁移,浸润以及神经元标志物表达的影响,以明确miR-708在脑IRI中的作用。方法:1.采用OGD/R处理人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,构建体外细胞IRI模型;2.提取对照及OGD/R组细胞的RNA,利用real-time PCR的方法检测miR-708的表达;3.采用Annexin V和PI双染利用流式细胞检测OGD/R后细胞的凋亡情况;4.通过转染miR-708的模拟物及对照检测其对OGD/R引起的细胞凋亡(AnnexinV)及细胞周期(流式分析)的作用;5.利用Transwell检测miR-708模拟物对OGD/R细胞运动和细胞侵袭能力的影响;6.利用免疫荧光检测神经元标志物MAP2的表达。结果:1.我们发现在体外细胞OGD/R模型中,细胞总凋亡率随着OGD处理时间的延长而增加。在OGD处理6小时后,细胞凋亡显著增加,达到对照的近10倍左右;2.我们采用4/48小时(氧糖剥夺4小时,复氧复糖48小时)的方案构建体外脑IRI模型,发现在缺氧再复氧后,miR-708的表达显著降低;3.在体外模型OGD/R中转染对照或miR-708的模拟物后,real-time PCR结果显示miR-708模拟物显著增加OGD/R中miR-708的表达水平,miR-708模拟物转染的细胞增殖能力较对照显著增强。此外,发现miR-708模拟物显著降低OGD/R细胞的凋亡水平,从29.19%降到16.19%。另外,发现miR-708模拟物显著降低G1期细胞百分比,且显著增加S期细胞百分比;4.利用Tranwell和划痕实验检测miR-708模拟物或对照转染的OGD/R细胞的迁移能力后发现,miR-708模拟物显著提高细胞的迁移能力,达到对照的1.5倍左右。此外,miR-708模拟物显著增加OGD/R细胞的浸润能力,达到对照的2倍左右;5.将miR-708的模拟物转染OGD/R细胞后,细胞中神经元标志物MAP2的表达明显高于对照组。结论:1.OGD/R引起SH-SY5Y细胞的凋亡随缺血的时间延长而增加;2.miR-708的表达在OGD/R后显著降低;3.在OGD/R细胞中转染miR-708模拟物后,SH-SY5Y细胞增殖能力显著增强,而细胞凋亡水平显著下降,细胞周期的G1期百分比显著下降,而S期细胞的百分比显著增加;4.miR-708显著增加OGD/R细胞的迁移和浸润能力;5.miR-708模拟物增加OGD/R细胞中神经元标志物MAP2的表达。第三部分miR-708通过靶向JAK1保护OGD/R引起的损伤目的:明确miR-708的靶基因,并阐明miR-708及其靶基因在减轻脑IRI中的作用机制。方法:1.通过生物信息学分析确定miR-708的靶基因;2.利用荧光素酶报告基因系统检测miR-708对其靶基因荧光素酶活性的作用;3.利用real-time PCR,免疫荧光和Western blot检测靶基因的表达;4.转染靶基因的siRNA,利用Hoechst检测靶基因对OGD/R细胞凋亡的作用,并利用Western blot检测凋亡相关信号通路蛋白的表达变化;5.利用免疫荧光和real-time PCR检测在OGD/R后干扰miR-708的靶基因JAK1表达后神经元标志物的表达变化。6.利用real-time PCR检测脑IRI模型及对照中JAK1的表达,并统计JAK1与miR-708表达的相关性,利用Western blot检测脑IRI模型及对照中JAK1及剪切型caspase3的蛋白表达。结果:1.通过生物信息学方法分析JAK1为miR-708的靶基因,发现miR-708显著降低野生型JAK1的荧光素酶活性,而miR-708对突变型JAK1的荧光素酶活性则无作用;2.miR-708类似物显著降低JAK1的表达;3.在OGD/R处理的SH-SY5Y细胞中,JAK1 mRNA表达显著增加,达到对照的3倍,与mRNA相同,OGD/R细胞中的JAK1的蛋白表达水平明显高于对照组;4.利用siRNA抑制JAK1的表达后,显著降低OGD/R细胞的凋亡水平显著降低,JAK1信号通路的下游分子STAT3的表达显著降低,剪切型Caspase3表达显著降低而Bc12家族的Mcl-1表达明显增加;miR-708模拟物同样显著降低JAK1及其下游分子STAT3的表达,并下调剪切型Caspase3的表达和上调Mcl-1的表达;3.miR-708模拟物和抑制JAK1的表达均显著增加OGD/R细胞中神经元标志物MAP2和NeuN的mRNA表达水平;4.与对照相比,大鼠脑IRI模型中JAK1的mRNA和蛋白表达水平显著增加,且在IRI的大鼠脑组织中Caspase3的表达明显高于对照组;相关性分析发现miR-708与JAK1表达呈现负相关。结论:1.JAK1为miR-708的靶基因,miR-708显著降低野生型JAK1的荧光素活性;2.在OGD/R细胞中,JAK1的转录(mRNA)和翻译(蛋白)水平都显著升高,在大鼠脑IRI模型中JAK1的表达也显著增加;3.与对照相比,miR-708模拟物转染的OGD/R处理的SH-SY5Y细胞中JAK1的mRNA和蛋白表达水平显著降低;4.siRNA干扰JAK1的表达后发现,OGD/R细胞的凋亡水平显著降低,凋亡相关蛋白Cleaved caspase3表达也显著降低;5.抑制JAK1表达后增加OGD/R后细胞中神经元标志物MAP2和NeuN的表达;6.大鼠脑IRI模型中JAK1的mRNA和蛋白表达水平显著增加,miR-708与JAK1在脑IRI中的表达呈负相关关系。