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Apelin作为一种血管活性肽,是APJ受体的内源性配体。已有研究证实Apelin/APJ主要分布在心血管系统,其中,在血管平滑肌细胞、心肌细胞以及血管内皮细胞中表达尤为显著,这提示Apelin/APJ系统与心血管系统生理病理的调控密切相关。动脉粥样硬化（Atherosclerosis,As）是心血管疾病的病理基础,单核细胞-血管内皮细胞粘附是AS发生发展的重要环节,课题组前期研究成果揭示Apelin-13能够促进活性氧（Reactive oxygen species,ROS）诱导单核细胞-血管内皮细胞粘附,但其具体机制尚未阐明。因此,在此基础上进一步深入研究Apelin/APJ系统促单核细胞-血管内皮细胞粘附的具体过程,将对AS的防治具有重要的科学意义和临床价值。文献表明,细胞内ROS的大量生成可诱导内质网应激,而持续的内质网应激可促进内质网自噬的产生。在正常的生理状态下,细胞内的内质网自噬可发生在一个较低的水平,有助于清除受损的内质网膜,维持内质网的正常形态和功能。当细胞受到某些刺激时,内质网自噬的水平会显著增加,导致机体出现一系列病理变化。因此,探讨Apelin/APJ系统对内质网自噬的具体调控过程将是本课题研究的关键问题。内质网自噬发生的重要依据是内质网自噬受体蛋白的激活。研究发现,SEC62是一类能够参与内质网应激调控的内质网自噬受体蛋白,运用生物信息学分析发现,Apelin和SEC62可能存在蛋白之间相互作用。这提示,Apelin可能激活SEC62诱导内质网自噬发生。进一步查阅文献,细胞内内质网应激的发生与叶酸代谢障碍有关,而ALDH1L1是参与叶酸代谢的重要酶类,因此推测表明Apelin可能通过诱导ALDH1L1表达促进SEC62依赖性内质网自噬的发生。但胞质中的ALDH1L1如何影响内质网自噬的过程仍不清楚,需要进一步深入探讨。ALDH1L1是尾锚定蛋白家族成员,其C末端可锚定于质膜发挥生物学功能。蛋白质的类泛素化是最近发现的一种新型的蛋白翻译后修饰过程,类泛素化修饰后的蛋白可转运定位至质膜,发挥生物学效应。UBL4A是一种小分子类泛素化蛋白,文献报道它可对尾锚定蛋白进行类泛素化修饰。进一步采用生物信息学软件分析发现尾锚定蛋白ALDH1L1的812位赖氨酸可能是类泛素化修饰的重要位点。此外,研究还表明尾锚定蛋白ALDH1L1锚定于质膜的过程还需要尾锚定蛋白识别因子ASNA1的协助。据此,本课题提出”ALDH1L1-812K位点的UBL4A类泛素化修饰诱导SEC62依赖性内质网自噬介导Apelin-13/APJ促单核细胞-血管内皮细胞粘附”的科学假说。为验证这一假说,研究内容将分为三个部分:（1）SEC62依赖性内质网自噬介导Apelin-13/APJ促单核细胞-血管内皮细胞粘附;（2）尾锚定蛋白ALDH1L1诱导SEC62依赖性内质网自噬介导Apelin-13/APJ促单核细胞-血管内皮细胞粘附;（3）ALDH1L1-812K位点的UBL4A类泛素化修饰诱导SEC62依赖性内质网自噬介导Apelin-13/APJ促单核细胞-血管内皮细胞粘附。本研究首次将Apelin/APJ系统、类泛素化修饰、尾锚定蛋白、内质网自噬、单核细胞-血管内皮细胞粘附这些部分有机的联系起来,阐明Apelin-13诱导UBL4A类泛素化修饰的ALDH1L1-812K位点,类泛素化修饰的ALDH1L1蛋白在ASNA1的作用下锚定于内质网膜,诱导SEC62依赖性内质网自噬的具体过程。这些是对Apelin/APJ系统促单核细胞-血管内皮细胞粘附机制研究重要的学术创新,对于深入揭示以APJ药物为靶点针对AS的防治提供了重要的实验依据。第一章SEC62依赖性内质网自噬介导Apelin-13/APJ促单核细胞-血管内皮细胞粘附目的:高脂高胆固醇喂养ApoE基因敲除(apolipoprotein E deficiency,ApoE-/-)小鼠构建动脉粥样硬化模型,探讨Apelin-13和APJ拮抗剂F13A对动脉粥样硬化小鼠主动脉窦AS斑块的影响;中山大学惠赠尸检冠状动脉血管石蜡蜡块共3对,探讨人冠状动脉AS斑块内细胞粘附分子ICAM1、VCAM1和内质网自噬受体蛋白SEC62的表达情况;细胞体外实验研究Apelin-13是否通过诱导SEC62依赖性内质网自噬促单核细胞-血管内皮细胞粘附。方法:选择雄性8周龄的ApoE-/-小鼠,共24只,随机分为ApoE-/-组、ApoE-/-+Apelin-13组、ApoE-/-+Apelin-13+F13A组,每组8只,高脂胆固醇饮食喂养8周后,检测ApoE-/-小鼠主动脉窦粥样斑块形成情况。随后,分别对上述分组腹腔注射生理盐水、Apelin-13、Apelin-13+F13A,每日1次,连续28天,Apelin-13和F13A的注射量均为每天5mg/kg。28天后处死小鼠,分离小鼠的主动脉弓,制作主动脉窦石蜡切片,HE染色检测主动脉窦处AS斑块的大小。免疫组化检测主动脉斑块中ICAM1、VCAM1、SEC62的表达情况。在人体尸检标本中,HE染色观察冠状动脉血管中斑块的大小,免疫组化检测ICAM1、VCAM1、BIP、CHOP、SEC62的表达情况。应用F13A、内质网应激抑制剂Salubrinal、自噬抑制剂3MA预处理,Western blot、免疫荧光、透射电镜检测上述因素对Apelin-13诱导的ICAM1、VCAM1、SEC62、BECLIN1、LC3表达、内质网自噬小体的形成以及单核细胞-血管内皮细胞粘附的影响。结果:HE染色结果显示F13A可以抑制Apelin-13诱导的ApoE-/-小鼠主动脉窦粥样硬化斑块体积增大;免疫组化结果显示F13A抑制Apelin-13诱导的ApoE-/-小鼠主动脉内斑块中ICAM1的表达;尸检标本HE染色结果显示动脉粥样硬化患者冠状动脉中可见明显斑块;免疫组化结果显示尸检动脉粥样硬化患者冠状动脉斑块中ICAM1、VCAM1、BIP、CHOP、SEC62、BECLIN1、LC3的表达较对照组明显增加。以上体内实验结果表明,Apelin-13可促进AS的发展,其原因可能与内质网自噬的激活有关。进一步研究发现,Apelin-13以浓度（01.0umol/L）和时间（024h）依赖性促血管内皮细胞中内质网自噬相关蛋白SEC62、BECLIN1、LC3的表达;透射电镜观察发现F13A可抑制Apelin-13诱导的血管内皮细胞中内质网自噬小体的形成;SEC62 siRNA抑制Apelin-13诱导的血管内皮细胞中ICAM1和VCAM1的表达和单核细胞-血管内皮细胞粘附,这些结果表明SEC62依赖性的内质网自噬可能参与Apelin-13促单核细胞-血管内皮细胞粘附。为进一步明确以上机制,使用内质网应激抑制剂Salubrinal、自噬抑制剂3MA预处理血管内皮细胞,Western blot和免疫荧光发现上述处理可减弱Apelin-13诱导的血管内皮细胞中SEC62、ICAM1、VCAM1表达以及LC3和SEC62的共定位,电镜结果显示内质网自噬小体的生成受到抑制。小结:（1）Apelin-13可促进ApoE-/-小鼠主动脉窦处AS斑块的增大,APJ的拮抗剂F13A能够抑制Apelin-13诱导的ApoE-/-小鼠主动脉AS斑块的增加。提示Apelin/APJ系统可能是防治AS的重要靶点。（2）Apelin-13可促进内质网自噬蛋白SEC62的表达,诱导内质网自噬促进单核细胞-血管内皮细胞粘附。第二章尾锚定蛋白ALDH1L1诱导SEC62依赖性内质网自噬介导Apelin-13/APJ促单核细胞-血管内皮细胞粘附目的:主要探讨Apelin-13对尾锚定蛋白ALDH1L1表达的影响,以及激活的ALDH1L1是否可以诱导SEC62依赖性内质网自噬促进单核细胞-血管内皮细胞粘附的过程。方法:免疫组化观察ApoE-/-组、ApoE-/-+Apelin-13组、ApoE-/-+Apelin-13+F13A各组主动脉AS斑块中ALDH1L1表达情况;在人体尸检标本中,免疫组化检测冠状动脉血管AS斑块中ALDH1L1的表达情况。分别以不同的浓度（0.001﹑0.01﹑0.1﹑1umol/L）的Apelin-13处理血管内皮细胞24小时,或者用1 umol/L的Apelin-13处理不同时间（0h﹑3h﹑6h﹑12h﹑24h）,Western blot检测Apelin-13对ALDH1L1的量效和时效关系的影响。分析ALDH1L1 siRNA后,Western blot检测对Apelin-13诱导的血管内皮细胞中SEC62、ICAM1、VCAM1表达的影响以及免疫荧光观察上述处理对SEC62和LC3、内质网膜蛋白KDEL和LC3共定位的情况,进一步证实Apelin-13是否可以通过对ALDH1L1的调控影响SEC62的表达,进而影响内质网自噬的调控。此外,构建ALDH1L1的高表达质粒,Western blot检测其对血管内皮细胞中SEC62表达的影响。结果:免疫组化结果显示F13A抑制Apelin-13诱导的ApoE-/-小鼠主动脉斑块中ALDH1L1的表达;尸检免疫组化结果显示动脉粥样硬化患者冠状动脉斑块中ALDH1L1的表达较对照组明显增加。以上结果说明ALDH1L1的表达增加可能与动脉粥样硬化斑块的大小具有正相关性。细胞实验结果显示,Apelin-13以浓度（01.0μM）和时间（024h）依赖性促血管内皮细胞中ALDH1L1的表达增加,F13A抑制Apelin-13诱导的血管内皮细胞中ALDH1L1的表达。免疫荧光结果显示ALDH1L1 siRNA减弱Apelin-13诱导的血管内皮细胞中SEC62和LC3的共定位以及内质网膜蛋白KDEL和LC3的共定位。这提示ALDH1L1可能是SEC62激活的上游蛋白,ALDH1L1 siRNA能够减弱Apelin-13诱导的SEC62依赖性内质网自噬的发生。高表达ALDH1L1,Western blot结果也显示内皮细胞中SEC62蛋白的表达增加,这进一步证实了SEC62的表达增加依赖于ALDH1L1的激活。小结:（1）Apelin-13能通过上调血管内皮细胞中ALDH1L1的表达,诱导SEC62依赖性内质网自噬,促进单核细胞-血管内皮细胞粘附。第三章UBL4A类泛素化修饰ALDH1L1-812K位点介导Apelin-13/APJ促单核细胞-血管内皮细胞粘附目的:UBL4A是一种类泛素化蛋白,可对底物蛋白进行类泛素化修饰。生物信息学预测发现ALDH1L1重要的类泛素化修饰位点为812位赖氨酸位点。文献表明,尾锚定蛋白识别因子ASNA1可转运尾锚定蛋白从胞质锚定至内质网膜。因此,本部分主要探讨Apelin-13是否可以通过UBL4A类泛素化修饰ALDH1L1的812位赖氨酸位点,促进单核细胞-血管内皮细胞粘附。方法:免疫组化检测ApoE-/-小鼠主动脉斑块中和尸检动脉粥样硬化患者冠状动脉斑块中UBL4A、ASNA1的表达情况。Western blot进一步检测Apelin-13及其APJ抑制剂F13A对血管内皮细胞中UBL4A、ASNA1量效时效关系。推测UBL4A是ALDH1L1的上游调控蛋白,为验证这一设想,采用Western blot、免疫荧光、透射电镜观察UBL4A siRNA对Apelin-13诱导的血管内皮细胞中ALDH1L1、SEC62、LC3、ICAM1、VCAM1表达的影响、内质网自噬小体的形成以及单核细胞-血管内皮细胞的粘附。为进一步验证UBL4A对ALDH1L1的类泛素化修饰位点是812位赖氨酸位点,将812位的赖氨酸突变为精氨酸,使用ALDH1L1-812K的突变质粒,Western blot和免疫荧光观察血管内皮细胞中SEC62、ICAM1、VCAM1的表达以及单核细胞-血管内皮细胞粘附情况。此外,Western blot还检测ASNA1 siRNA对Apelin-13诱导的血管内皮细胞中BIP、SEC62、ICAM1、VCAM1表达的影响。结果:免疫组化结果显示F13A抑制Apelin-13诱导的ApoE-/-小鼠主动脉中UBL4A、ASNA1的表达增加;尸检免疫组化结果显示动脉粥样硬化患者冠状动脉中UBL4A、ASNA1的表达较对照组明显增加。这提示UBL4A、ASNA1的表达增加可能与动脉粥样硬化斑块的大小具有正相关性。细胞实验进一步验证了Apelin-13以浓度（01.0μM）和时间（024h）依赖性促UBL4A、ASNA1的表达增加,F13A抑制Apelin-13诱导的血管内皮细胞中UBL4A、ASNA1的表达。Western blot和免疫荧光结果显示UBL4A siRNA抑制Apelin-13诱导的血管内皮细胞中ALDH1L1、SEC62、LC3、ICAM1、VCAM1表达、减少内质网自噬小体的形成、降低单核细胞-血管内皮细胞粘附。突变ALDH1L1的812位赖氨酸位点,Western blot和免疫荧光观察发现Apelin-13诱导的血管内皮细胞中SEC62、ICAM1、VCAM1的表达降低、单核细胞-血管内皮细胞粘附减少。此外,Western blot还发现ASNA1 siRNA可抑制Apelin-13诱导的血管内皮细胞中BIP、SEC62、ICAM1、VCAM1的表达。结论:Apelin-13通过上调UBL4A类泛素化修饰ALDH1L1的812位赖氨酸位点,在ASNA1的协助下,促进ALDH1L1锚定于内质网膜,诱导SEC62依赖性内质网自噬的激活,促进单核细胞-血管内皮细胞粘附。