论文部分内容阅读
【研究背景及目的】肝细胞癌（以下简称肝癌）是我国常见的实体恶性肿瘤之一。根据全国肿瘤登记中心的陈万青[1]教授在著名杂志CA Cancer J Clin上发表的2015年中国癌症统计数据报告,肝癌居中国男性最常诊断的肿瘤第4位。近年来,随着乙肝疫苗的普及、黄曲霉毒素的控制以及安全注射意识提高,肝癌的危险因素预防取得了一定成效,其发病率呈下降趋势。然而,肝癌的恶性程度仍不容小觑。2015年中国癌症统计数据指出,肝癌位列肿瘤死亡病因的第3位,2015年全国估计新发病例46.61万人,而死亡人数是42.21万人,发病率与死亡率之比居所有肿瘤之首。肝癌死亡率高的主要原因是早期发现较难、术后易复发转移、中晚期肿瘤有效治疗手段少。因此,亟需深入研究其发生发展的机制,积极寻找新的诊断标志物和治疗靶点以改善其预后。微小RNA（microRNA,miRNA）是一类内源性单链非编码RNA,其长度为18-22个核苷酸,主要通过互补结合靶基因mRNA的3’端非翻译区（3′untranslation region,3′UTR）而促进该mRNA的降解或阻断其翻译过程,从而发挥转录后调控效应,影响基因的表达。近年来,miRNA在肝癌发生发展过程中的作用成为研究热点,由于miRNA在血清和组织中较为稳定,它可能作为良好的诊断标志物,尤其是无创性的血清学指标,同时,随着药物传输体系的发展,已有miRNA相关的治疗药物进入临床实验,以上研究均表明miRNA在肝癌的诊断和治疗中具有良好的应用前景[2]。miR-541位于人14号染色体上Dlk1/DIO3印记基因区的miRNA簇中。近年来,该簇上的多个miRNA均被报道与恶性肿瘤的发生发展相关。我们前期研究发现对肝癌细胞恶性生物学行为具有抑制作用的转录因子肝细胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4α）可转录调控DLK1/DIO3印记基因区的miR-379-656簇[3],其中正包括了miR-541。我们进一步的功能研究结果则显示受HNF4α调控的28个miRNA中,miR-541对多种肝癌细胞株增殖能力的抑制作用最强,以上结果提示miR-541可能在肝癌的发生发展中发挥重要作用。既往关于miR-541的功能研究报道很少,关于其在肿瘤中的作用,仅有研究报道其可在体外抑制乳腺癌细胞的增殖[4]和非小细胞肺癌的进展[5],关于其在肝癌中的作用并未见报道。因此,本课题旨在全面探讨miR-541在体内外对肝癌细胞恶性生物学行为的影响,通过软件预测下游靶基因,并通过报告基因等实验对靶基因进行验证,明确miR-541作用的分子机制,为肝癌的临床治疗提供新的靶点。【实验方法】一、miR-541对肝癌细胞恶性生物学行为的影响（一）miR-541在体外对肝癌细胞株增殖能力的影响利用化学合成并修饰的miR-541寡核苷酸拟似物（miR-541 mimic）上调肝癌细胞株YY-8103和PLC/PRF/5中miR-541的表达,或利用与miR-541序列互补并经过2′-甲氧修饰的寡核苷酸抑制物（miR-541 inhibitor）抑制上述肝癌细胞中miR-541的作用,通过CCK-8（cell counting kit-8）试剂盒检测miR-541对肝癌细胞增殖能力的影响。（二）miR-541对肝癌细胞株平板培养皿中克隆形成能力的影响肝癌细胞株YY-8103和PLC/PRF/5转染miR-541 mimic或miR-541 inhibitor后,观察miR-541对肿瘤细胞在平板培养皿中克隆形成能力的影响。（三）miR-541在体外对肝癌细胞株迁移的影响利用miR-541 mimic上调肝癌细胞株YY-8103及PLC/PRF/5中miR-541的表达,或利用miR-541 inhibitor抑制miR-541的作用后,通过transwell实验比较miR-541mimic组与其对照组或miR-541 inhibitor组与其对照组细胞迁移能力的变化。（四）miR-541在体外对肝癌细胞株侵袭的影响肝癌细胞株YY-8103和PLC/PRF/5中利用miR-541 mimic上调mi R-541的表达,或利用miR-541 inhibitor抑制miR-541的作用,通过transwell实验观察并比较miR-541mimic与其NC组或miR-541 inhibitor与其NC组细胞侵袭能力的变化。（五）miR-541对肝癌细胞药物敏感性的影响肝癌细胞株YY-8103和PLC/PRF/5转染miR-541 mimic及其对照或miR-541inhibitor及其对照后,加入不同梯度稀释的药物索拉菲尼、阿霉素,利用CCK-8试剂盒检测活细胞数,绘制细胞生存曲线,计算IC50,比较各组IC50大小。（六）miR-541对肝癌细胞株在小鼠皮下成瘤能力的影响利用可高效表达mi R-541的重组复制缺陷型腺病毒Ad-miR-541和对照病毒Ad-MAX感染肝癌细胞株YY-8103,将两组细胞分别种植于同一裸鼠的双侧皮下（2×106细胞/侧）（n=6）,定期测量双侧肿瘤的大小,记录并进行比较,3周后处死小鼠,比较双侧肿瘤的体积及重量的差别,并进行统计分析。二、miR-541抑制肝癌的作用机制（一）软件预测miR-541潜在靶基因利用miRbase数据库关联的6个目前常用靶基因预测软件TargetScan、miRDB、microRNA.org、DIANA MICROT、TARGETMINER和RNA22-HAS预测miR-541的潜在靶基因,并取其交集。（二）miR-541对靶基因表达的影响利用Real-time PCR及Western Blot法检测肝癌细胞株YY-8103和PLC/PRF/5转染miR-541 mimic或miR-541 inhibitor后其潜在靶基因自噬相关基因2同源体A（autophagy related 2 homolog A,ATG2A）和Ras相关蛋白Rab-1B（Ras-related protein Rab-1B,RAB1B）的mRNA及蛋白的表达情况。（三）报告基因验证靶基因真实性根据软件预测的miR-541与ATG2A和RAB1B 3′UTR区的结合位点,构建相应的荧光素酶报告基因质粒,检测mi R-541对该报告基因的影响。同时将结合位点突变后,检测mi R-541对突变后的报告基因的影响,以验证ATG2A和RAB1B是否为miR-541的直接靶基因。（四）明确ATG2A和RAB1B是否部分介导miR-541对肝癌的抑制作用利用靶基因小干扰核苷酸片段下调两个靶基因的表达,观察肝癌细胞株增殖能力的影响,明确靶基因的小干扰RNA能否模拟miR-541 mimic的功能;共转染mi R-541inhibitor及其靶基因小干扰片段,明确miR-541是否可以部分抑制靶基因抑制肝癌的作用。（五）miR-541对肝癌细胞株自噬的作用肝癌细胞株PLC/PRF/5转染靶基因的小干扰RNA、转染miR-541 mimic或mi R-541 inhibitor后,利用Western Blot法检测自噬关键蛋白LC3表达情况。利用Ad-mRFP-GFP-LC3双标记的腺病毒感染肝癌细胞,同样的转染转染靶基因的小干扰RNA、miR-541 mimic或inhibitor及其对照,利用激光共聚焦显微镜拍照,比较miR-541mimic组或inhibitor组与其对照组自噬情况（红绿荧光merge后的黄色实点）或自噬溶酶体（红绿荧光merge后的红色实点）的差异。三、统计学处理数据采用SPSS 18.0统计软件包进行分析。两组间比较,若方差齐性则采用双尾的Student’s t检验;若方差非齐性则采用非参数秩和检验Mann-Whitney U检验。P<0.05为具有显著性统计学差异。【实验结果】一、miR-541在体内外抑制肝癌细胞的恶性生物学行为（一）miR-541在体外抑制肝癌细胞株的增殖能力mi R-541 mimic上调miR-541的表达后抑制肝癌细胞株YY-8103和PLC/PRF/5的增殖,而利用miR-541 inhibitor抑制miR-541的作用后促进肝癌细胞株YY-8103和PLC/PRF/5的增殖。（二）miR-541抑制肝癌细胞株平板克隆形成能力mi R-541 mimic抑制YY-8103和PLC/PRF/5细胞的平板克隆形成能力,miR-541inhibitor可促进上述肝癌细胞株的平板克隆形成能力。（三）miR-541在体外抑制肝癌细胞株的迁移mi R-541 mimic可显著抑制肝癌细胞株YY-8103和PLC/PRF/5的迁移能力,mi R-541 inhibitor抑制mi R-541的作用后可显著促进肝癌细胞株的迁移能力。（四）miR-541在体外抑制肝癌细胞株侵袭mi R-541 mimic上调miR-541的表达显著抑制而miR-541 inhibitor抑制miR-541的作用可促进肝癌细胞株YY-8103和PLC/PRF/5的侵袭能力。（五）miR-541增加肝癌细胞株对索拉菲尼、阿霉素的敏感性通过比较IC50发现,miR-541 mimic可增加肝癌细胞株YY-8103和PLC/PRF/5对上述2种药物的敏感性,miR-541 inhibitor则降低肝癌细胞株对上述药物的敏感性。（六）miR-541对肝癌细胞株YY-8103在裸鼠皮下成瘤能力的影响将Ad-mi R-541病毒及Ad-MAX对照病毒分别感染YY-8103细胞后种植于裸鼠双侧皮下,于种植4日后Ad-MAX组6只小鼠均可测量到很小的肿瘤,随时间延长逐渐增大,而种植4日后Ad-miR-541仅有1只可测量到很小的肿瘤,3周后处死小鼠时Ad-miR-541组4只可测量到较小的肿瘤（66.7%）,其肿瘤大小及重量显著较对照组小。二、miR-541通过ATG2A和RAB1B抑制肝癌的作用（一）软件预测发现ATG2A和RAB1B是miR-541的潜在靶基因利用TargetScan等6个靶基因预测软件预测miR-541的潜在靶基因,并取其交集后发现ATG2A和RAB1B 3′UTR区上有多个miR-541结合位点,是miR-541的潜在靶基因。（二）miR-541抑制ATG2A和RAB1B的mRNA及蛋白的表达Real-time PCR和Western Blot结果显示,miR-541 mimic可抑制肝癌细胞株YY-8103和PLC/PRF/5中ATG2A和RAB1B的mRNA及蛋白的表达;而miR-541inhibitor可促进ATG2A和RAB1B的mRNA及蛋白的表达。（三）报告基因实验证实ATG2A和RAB1B是miR-541的直接靶基因双荧光素酶报告基因实验证实,miR-541可显著抑制ATG2A和RAB1B 3′UTR荧光素酶报告基因活性,将miR-541与ATG2A和RAB1B 3′UTR区的结合位点突变后,该抑制所用消失,证实ATG2A和RAB1B是miR-541的直接靶基因。（四）ATG2A和RAB1B部分介导miR-541对肝癌的抑制作用靶基因小干扰核苷酸片段下调两个靶基因的表达,并抑制肝癌细胞株增殖能力;miR-541 inhibitor可促进肝癌细胞株的增殖和迁移能力,而靶基因小干扰可部分抑制miR-541 inhibitor的作用。（五）miR-541抑制肝癌细胞株的自噬Western Blot结果显示下调靶基因ATG2A和RAB1B后自噬关键蛋白LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值减少,LC3双荧光标记示踪显示肝癌细胞自噬减弱,表明下调自噬相关靶基因确实可以抑制肝癌细胞的自噬。miR-541 mimic组较对照组LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值减少,当饥饿及雷帕霉素激活自噬的过程中,miR-541可抑制该比值的增加;激光共聚焦显微镜观察可见miR-541可抑制肝癌细胞的自噬流;抑制miR-541的作用后,促进肝癌细胞的自噬;表明miR-541可能部分通过抑制ATG2A和RAB1B抑制肝癌细胞的自噬。【结论】一、miR-541在体内外抑制肝癌细胞的多种恶性生物学行为。二、ATG2A和RAB1B是miR-541的直接靶基因。三、miR-541通过负调控自噬相关基因抑制自噬从而发挥抑制肝癌的作用。