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目的: 1.红豆蔻、草豆蔻、益智3味山姜属中药的最佳提取工艺条件,为3味山姜属中药的化学成分分析及其药理作用研究奠定基础。 2.研究高良姜、大高良姜、红豆蔻、草豆蔻、益智5味山姜属中药乙醇提取部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位的高效液相色谱指纹图谱,分析比较其特征峰所代表的化学成分相关性。 3.采用高效液相色谱法对高良姜和草豆蔻石油醚部位中的高良姜素、山姜素、乔松素、小豆蔻明和桤木酮进行含量测定。 4.通过观察高良姜、大高良姜、红豆蔻、草豆蔻、益智5山姜属中药乙醇提取物对胃溃疡寒证大鼠胃溃疡指数、血清环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)含量及cAMP/cGMP比值的影响,比较其温胃散寒药效差异。 方法: 1.分别采用加热回流提取法、超声波提取法和冷浸提取法进行提取,确定最佳提取方法,分别采用单因素考察方法确定提取溶剂、乙醇浓度、提取时间和提取次数的因素水平,运用L9(34)正交试验方法优选红豆蔻、草豆蔻、益智的提取工艺,采用药材提取溶剂、溶剂倍量、提取时间、提取次数为因素的正交设计,以干膏率作为筛选指标,对其提取工艺进行优化。 2.采用高效液相色谱法(HPLC)研究5味山姜属中药不同极性部位的指纹图谱,色谱条件:采用phenomenex-C18(250×6mm,5μm)色谱柱,流动相为乙腈-水溶液,梯度洗脱,流速:1.0mL/min,柱温:30℃,检测波长220nm;采用国家药典委员会相似度评价软件分析比较其化学成分相关性。 3.采用高效液相色谱法(HPLC)对高良姜、草豆蔻石油醚部位的高良姜素、山姜素、乔松素、小豆蔻明、桤木酮进行含量测定。色谱条件:采用phenomenex-C18(250×4.6mm,5μm)色谱柱,流动相为乙腈-水溶液,梯度洗脱,流速:1.0mL/min,柱温:30℃,检测波长260nm。 4.取SPF级SD大鼠90只,随机取其中10只作为空白组,剩下的大鼠采用寒凉药冰知母水提液和冰食醋刺激复制胃溃疡寒证动物模型。造模成功后将大鼠随机分为模型组、西咪替丁组、附子理中丸组、高良姜组、大高良姜组、红豆蔻组、草豆蔻组、益智组共8组。空白组、模型组灌服蒸馏水,其余各组分别灌服各受试药物。采用酶联免疫法测定血清cAMP、cGMP含量,计算cAMP/cGMP比值,观察5山姜属中药对胃实寒证大鼠血清cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值的影响。 结果: 1.最佳提取工艺为:乙醇加热回流提取,采用60%乙醇,溶剂倍量为30倍,提取时间为4h,提取次数2次。 2.5味山姜属中药乙醇提取部位化学成分相似度分别为0.935、0.944、0.723、0.882、0.047;石油醚部位化学成分相似度分别为0.741、0.855、0.61、0.51、0.68;乙酸乙酯部位化学成分相似度分别为0.955、0.805、0.371、0.794、0.345。结果表明,5味山姜属中药不同极性部位的指纹图谱特征峰所代表的化学成分有一定的相似性。 3.高良姜素浓度线性范围为y=31577x-58.17,r=0.9999;山姜素y=153051x+54.07,r=0.9991;桤木酮y=74113x+9.53,r=1;乔松素y=29043x+25.89,r=0.9994;小豆蔻明y=69672x+0.87,r=0.9995,结果表明高良姜素、山姜素、桤木酮、乔松素、小豆蔻明在线性范围内线性关系良好;样品平均回收率分别为山姜素97.91%,RSD为1.35%;乔松素97.83%,RSD为1.35%;高良姜素98.62%,RSD为1.93%;小豆蔻明101.17%,RSD为0.86%;桤木酮99.43%,RSD为0.34%,结果表明方法的准确性良好。 4,模型组大鼠胃溃疡指数与空白组比较显著升高(P<0.01),给予治疗药后,各治疗药组大鼠胃溃疡指数与模型组相比显著降低(P<0.01或P<0.05),高良姜组、红豆蔻和益智组与模型组相比显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。模型组大鼠血清的cAMP含量比空白组显著降低(P<0.01);模型组cAMP值、cAMP/cGMP比值与空白组比明显降低,差异有统计学意义(P<0.01),cGMP值改变不明显;给予治疗药后,各治疗药组大鼠血清的cAMP含量与模型组相比显著升高(P<0.01或P<0.05),cAMP/cGMP比值升高,cGMP值改变不明显。 结论: 1.本提取方法简单、提取率高,为3味山姜属中药的化学成分分析及其药理作用奠定基础。 2.中药HPLC指纹图谱能够全面反映中药化学成分整体群集特征,本试验对5味山姜属中药不同极性提取物的指纹图谱进行探索性研究,各色谱峰在客观上有一定的相似性,为探讨山姜属中药亲缘关系与化学成分相关性提供思路。 3.高良姜和草豆蔻石油醚部位的高良姜素、乔松素、桤木酮化学成分分布不同,含量有较大的差异。该方法简便、准确、重现性好,可用于该属中药主要化学成分的含量测定。 4.本实验结果表明高良姜、大高良姜、红豆蔻、草豆蔻和益智5味山姜属中药对胃黏膜有一定的保护作用。模型组cAMP值与空白组比明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);cGMP值改变不明显。治疗后各组cAMP值显著升高,cAMP/cGMP比值有上升的趋势。进一步证实山姜属中药对胃溃疡寒证大鼠有一定的改善作用。