我国是世界马业大国,但并非马业强国。马存栏量虽大,却在现代马术的国际竞技场上未见身影。现代马术用马的匮乏,成为我国马产业发展的重要制约因素。胚胎移植技术已成熟应用于牛、羊等家畜的繁育生产,但马胚胎移植的各环节技术尚不完全成熟,相关研究与应用与马产业的发展不相适应。因此,本研究针对我国马业发展的技术需求,开展其发情鉴定、人工授精、非手术法胚胎采集和胚胎移植等马胚胎移植关键生物技术的研究。在此基础上,开展了卵巢的运输、卵母细胞采集、卵母细胞体外成熟、体细胞系的建立、细胞融合、体细胞核移植等马克隆胚胎体外构建技术的研究,其研究结果如下:1、母马发情的准确鉴别。摸索了 3种发情方法,发现B超检查法鉴定母马发情的成功率达到100%,显著高于外部观察法(47.3%)和直肠触摸法(85%),P<0.05。2、母马发情的有效诱导。建立了母马发情和同期发情的有效诱导方法,母马排卵第5 d,肌肉注射0.2 mg PGF2α后的发情率为63.2%,高于肌肉注射1500 IU PMSG和自然发情的比例(47.2%、0),P<0.05。有效的诱导6个品种马的发情,发情周期显著缩短,分别为 11.7±3.1、12.2±2.8、11.5±1.9、12.8±2.1、11.8±2.5 和 12.7±2.3 d。注射0.2 mg黄体酮和PGF2α方法母马的同期发情率为76.4±2.6%,显著高于单纯注射黄体酮组的62.8±2.1%和对照组的16.7± 1.2%,P<0.05。3、母马排卵的有效调控。建立了母马排卵的有效调控方法,关键在卵泡发育、激素类型和剂量的选择。当卵泡直径≥30 mm,静脉注射1500 IU hCG,48 h内的排卵比例为84.3%,显著高于FSH+LH组(31.6%)和对照组(15.8%)(P<0.05),6 个品种马分别在 41.2±2.3、43.9±2.7、42.3±1.6、39.7±3.1、40.9±2.9 和 39.8±2.4 h 时排卵。发现左侧卵巢的排卵率比右侧的高,59.5%排卵发生在左侧,高于右侧的40.5%(P<0.05)。4、马精液的保存与授精。建立了马精液的常温、低温和超低温保存的方法,常温(22℃)保存20 min,HN-SD(本实验室制备)和INRA96(IMV商品)组的精子活率分别为65.6±2.3%和68.6±1.2%,显著高于脱脂牛奶组的53.5±3.2%(P<0.05)。低温(0～4℃)保存24 h,HN-SD和INRA96组的精子活率分别是65.5±2.3%和67.7±2.1%,高于脱脂牛奶组的49.5±3.4%(P<0.05)。液氮(-196℃)保存精液1d后,INRA96组的精子活率为44.3±2.2%,HN-SD组为36.2±2.3%,高于脱脂牛奶组的21.3±1.8%(P<0.05)。摸索出了最适的输精部位,发现输精的不同部位对母马受胎率的影响不同,子宫角输精的母马情期受胎率为85.4%,显著高于子宫输精(78.4%)和自然交配(25%)(P<0.05)。保鲜精液的情期受胎率为61.1%,低于鲜精的84%,但高于冷冻精液的40%(P<0.05)。5、马胚胎的非手术法采集。建立了马胚胎的非手术采集方法,选取乳酸钠林格注射液作为冲胚液,在马受孕后5～8 d进行冲胚,采集的时间是关键环节。本研究胚胎采集成功率为72.8%。不同时间采集胚胎的成功率不同,5月份的胚胎采集成功率最高,为88.9%,10月份成功率最低,为42.9%。桑椹胚采集成功率为70.6%。6、马胚胎的非手术法移植。建立了马胚胎的非手术移植方法,选择排卵后4～7 d的受体马,选取IMV胚胎保存液进行子宫体移植。试验组HN-EHM和IMV胚胎保存液的胚胎移植成功率分别为80%和83.3%,高于乳酸钠林格注射液试验组(75%)。胚胎低温保存24 h后,移植成功率为60%。桑椹胚移植成功率为90.9%。7、马卵巢的运输。本试验获得马卵巢体外运输过程中保存液的合适温度,夏季为33～37℃,冬季为30～35℃。8、马卵丘-卵母细胞复合体(COCs)的采集。抽吸法+切割法的采集成功率最高,为73.3%,高于切割法(64.6%)和抽吸法(54.8%)的成功率(P<0.05)。发现繁殖季节的卵巢中大、中、小卵泡的比例分别是20.9%、51%和28.1%,非繁殖季节的比例分别是3.1%、51.9%和45%。9、马卵母细胞的体外成熟。摸索了马卵母细胞体外培养成熟的条件,5%CO2、37℃、饱和湿度培养,紧凑型(Cp)卵母细胞培养32～36 h,扩展型(Ex)培养24～28 h。结果发现不同类型的COC其成熟率不同,不同繁殖季节,卵母细胞的成熟率也不同。繁殖季节,马扩展型(Ex)的成熟率为58.6%,高于紧凑型(Cp)的成熟率36.5%(P<0.05),非繁殖季节,成熟率分别为29.1%和49.2%(P<0.05)。添加ActA能提高紧凑型(Cp)卵母细胞的成熟率,在繁殖、非繁殖季节卵母细胞成熟率分别达到 47.3%和 42.2%。10、马卵母细胞的孤雌激活。摸索了马卵母细胞孤雌激活的条件,本试验选取离子霉素进行孤雌激活,结果发现ActA促进马Cp型卵母细胞孤雌激活胚胎的发育,2-细胞(57.9%)、4-细胞(36.8%)的比例分别高于对照组(P<0.05)。不同的卵母细胞类型对卵母细胞孤雌激活后胚胎的发育没有影响。在马的繁殖季节,孤雌激活胚胎发育到2-细胞期、4-细胞、8-细胞和桑椹胚的比例分别是50%(42/80)、35.7%(30/84)、13.1%(11/84)和6%(5/84),高于非繁殖季节同时期的比例,(P<0.05)。在马的非繁殖季节,孤雌激活的胚胎与颗粒细胞共培养后,发育到2-细胞、4-细胞的比例分别为41.7%和25%,显著高于对照组的比例(P<0.05),获得1枚桑椹胚(2.8%)。11、马体细胞克隆胚的构建及体外培养。摸索了不同融合电压对重构胚胎融合率的影响,克隆胚胎置于38.5℃、5%C02、饱和湿度培养箱中培养,结果发现采用140 V,20μs,融合2次,重构胚胎融合成功率达到72%。马驹成纤维细胞的融合率、2-细胞,4-8细胞和桑椹胚的比例分别为77.4%、41.5%、33.9%和15.1%,高于成年马体细胞的相应比率(P<0.05)。用非手术法将构建好的8枚桑椹胚移植到受体马的子宫体中,没有获得克隆马。通过上述研究,本研究获得成熟的马胚胎移植技术体系,为实现规范化、商业化、市场化的繁殖现代马术用马提供的技术方案。在此基础上,研究体外诱导成熟的马卵母细胞构建克隆胚胎的技术,为我国突破马克隆技术奠定基础。