甘草是我国常用的大宗药材,具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功效,被广泛应用于临床配方。甘草酸是甘草的主要药效成分,其含量是我国《药典》规定的重要指标之一。大量研究表明,近年来栽培甘草普遍甘草酸含量较低,达不到《药典》标准,严重制约甘草资源的可持续发展和利用。因此,如何提高甘草中甘草酸含量是保证甘草质量的关键问题。已有研究表明,甘草酸生物合成途径不是孤立存在的,它与其他次生代谢产物如脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)、细胞分裂素(6-BA)、甘草苷(Liquiritin)、甘草素(Liquiritigenin)等生物合成途径相互连接并构成网络。本实验室的前期研究发现,外源喷施适当浓度的ABA能够提高甘草中甘草酸的含量,但其作用机制尚未可知。9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-Cis-Epoxycarotenoid Dioxygenase,NCED)基因是ABA合成途径中的限速酶基因之一,其表达量直接影响ABA的合成。因此,根据甘草酸生物合成网络我们推测,NCED基因表达量的差异会导致脱落酸含量的差异,进而可能影响甘草酸生物合成途径中关键酶的活性,最终调控甘草酸的合成量。转基因技术是将目的基因插入到植物外植体的基因组中,并使其在后代植株的特定组织中稳定的表达。利用该技术,我们可以考察目的基因在植物体内的过表达情况,进而分析该基因的表达量差异对次生代谢产物生物合成的影响机制。本论文采用转基因技术,尝试用3种方法——基因融合法、多片段一步克隆法以及根特异性通用表达载体法来构建携带甘草NCED4基因的根特异性植物双源表达载体,并将该基因进行遗传转化,最后培育NCED4基因过表达的再生植株。本论文为进一步研究NCED4基因表达量对甘草酸生物合成的调控机制奠定了基础,目前取得的主要成果如下：(1)成功采用多片段一步克隆法构建了携带甘草NCED4基因的根特异性表达载体pCA-TobRB7-NCED4-2,并成功转入到根癌农杆菌EHA105中,完成了工程菌EHA-TobRB7-NCED4-2的构建。(2)成功构建了根特异性通用表达载体pCA-TobRB7并保存。在此基础上,构建了携带甘草NCED4基因的根特异性表达载体pCA-TobRB7-NCED4-3,并成功转入到根癌农杆菌EHA105中,完成了工程菌EHA-TobRB7-NCED4-3的构建。(3)从载体构建准确率、连接效率以及实验周期来分析3种载体构建方法的优劣。从准确率来看,基因融合法经多次重复实验仍出现连入片段不完全的现象,准确率低,因此该种用于方法暂不能用于构建携带甘草NCED4基因的表达载体；而多片段一步克隆法和根特异性通用表达载体法的准确率均较高,测序结果表明,连入目的基因片段完整、顺序正确。从连接效率来看,经多片段一步克隆法构建的表达载体转化感受态细胞后,阳性率仅为50%,效率较低；经根特异性通用表达载体法构建的载体转化感受态细胞后,阳性率为90%,效率较高。从实验周期长短来看,多片段一步克隆法仅需一次即可完成多片段基因重组,实验周期最短；而根特异性通用表达载体法需要分两次完成,第一次完成通用载体的构建,第二次才能将目的基因连入,但在通用载体构建成功后可将其保存,今后如需构建其他根特异性表达载体,在TobRB7启动子序列后选择其他合适酶切位点将目的基因连入即可,从长远来看,根特异性通用表达载体法更为方便快捷、省时省力。综上所述,我们认为根特异性通用表达载体法准确率高、连接效率高、实验周期较短并且应用范围广,是最适用于构建携带甘草NCED4基因的表达载体构建方法；多片段一步克隆法更适用于任何2个以上片段的快速定向克隆,但效率稍低,需严格掌握重组体系中各片段的加入比例。(4)成功通过根癌农杆菌介导法,将含有甘草NCED4基因的工程菌转入甘草下胚轴。之后转入诱导培养基进行根特异性过表达NCED4基因的愈伤组织培养。甘草是中医临床中使用频率最高的药材之一,享有“十药九甘草”之美誉。近年来,栽培甘草已成为甘草药材市场的主流商品,但栽培甘草的甘草酸含量普遍偏低,达不到药典标准,是制约甘草可持续发展的瓶颈。进行优良品种选育是提高甘草酸含量的有效途径。发掘与高甘草酸形成相关的分子标记是进行优良种质资源选育的重要基础,对甘草的分子育种具有重要意义。本文以甘草酸生物合成途径下游中的关键酶基因——13-香树脂醇合成酶(β-AS)基因作为研究对象,采用PCR-测序的方法对其内含子部分多态性进行检测,并尝试分析其内含子多态性与甘草酸含量的相关性,从而筛选出与高甘草酸含量相关的分子标记,为甘草的分子育种奠定基础。本论文的主要成果如下：(1)发现β-AS基因第2内含子506 bp、512 bp,第6内含子1710bp-1717bp、1744 bp、1745 bp,第8内含子2187 bp-2198bp、2216 bp存在变异位点。变异位点类型如下：①单核苷酸多态性(SNPs):甘草β-AS基因内含子共有3处SNPs,在1742 bp处存在T-C颠换,1743 bp存在T-C颠换,2216 bp存在T-G颠换。②等位基因杂合多态性：甘草β-AS基因内含子共有3处等位基因杂合多态性位点,在506bp处存在C/G杂合,512bp处存在C/G杂合,2216 bp处存在T/G杂合。③插入／缺失突变(Tndels):甘草β-AS基因全长共有2处Indels,在1710bp-1016 bp存在AT缺失,在2187bp-2198bp处存在ATATTGACTTAA共12个碱基的缺失。④拷贝数多态性(CNVs):甘草β-AS基因可能存在2个以上拷贝。对164个甘草样本β-As基因内含子进行多态性检测,除去等位基因杂合多态性和拷贝数多态性的样本后,共有138个纯合型样本。(2)运用灰色关联法分析各变异位点与甘草酸含量的相关性,发现1710bp、1712 bp、1714 bp、2187 bp、2189 bp、2193 bp、2197 bp、2198bp位点的碱基类型与甘草酸含量呈显著相关(r>0.65)。依据以上8个高关联变异位点将138个纯合型样本划分B1-B5共5种类型,其中B5(1710bpA、1712 bp A、1714 bp A、2187 bp A、2189 bp A、2193 bpA、2197 bp A、2198 bp A)型样本甘草酸含量最高。对138个纯合型样本的甘草酸含量进行聚类分析,按照甘草酸含量由低到高排序为Ⅰ组(0.54%-0.92%)、Ⅱ组(0.97%-1.26%)、Ⅲ组(1.29%-2.46%)、Ⅳ组(2.54%-3.33%),其中,B5(1710bp A、 1712bp A、1714bpA、2187bpA、2189bpA、2193bpA、2197bpA、2198bp A)型样本在4个组之间所占比例存在显著性差异(PB5=0.002<0.05),且B5型在甘草酸含量最高组(Ⅳ组)中所占比例最高(66.67%)。综上所述,B5为与高甘草酸含量相关的分子标记。(3)分析了甘草各单倍型与甘草酸含量的相关性。138个纯合型样本可被分为G1-G7共7种单倍型。其中,G7(1710-1715 bp ATATAT,1744-1745 bp TC,2187～2198 bp ATATTGACTTAA,2216 bp G)型样本甘草酸含量最高。对不同单倍型在4个甘草酸含量积累组中所占比例进行分析后发现,G7 (1710-1715 bp ATATAT,1744-1745 bp TC, 2187～2198 bp ATATTGACTTAA,2216 bp G)型样本甘草酸含量在4个组之间所占比例存在显著性差异(PG7=0.001<0.05),且G7型在甘草酸含量最高组(Ⅳ组)中所占比例最高(66.67%)。综上所述,G7为高甘草酸含量相关的单倍型类型。(4)综合分析β-AS基因变异位点及单倍型与甘草酸含量相关性,我们发现G7单倍型在1710bp、1712bp、1714bp、2187bp、2189bp、2193bp、2197bp的碱基类型均为A,这与B5这一分子标记类型完全相同,由此我们可以得出一致性的结论,即B5为与高甘草酸含量相关的分子标记,G7为高甘草酸含量相关的单倍型类型。该分子标记所在的第6-第8内含子可作为候选检测区域,用于筛选品质优良的甘草种质资源。