【摘 要】
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细胞的正常运转需要通过不同细胞器之间的信息传递和物质交换进行紧密调节。自噬流和内吞流是细胞进行信号传递和物质运输的两条关键途径,对细胞稳态、信号转导和细胞免疫至关重要。目前用于监测自噬流和内吞流的荧光探针大多是通过对p H值变化和极性转变的检测间接实现对内吞流和自噬流的监测。基于此设计的荧光探针对细胞微环境变化高度敏感,使得其成像性能缺乏足够的稳定性。生物正交点击反应是典型的双组分反应,可以在生理
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细胞的正常运转需要通过不同细胞器之间的信息传递和物质交换进行紧密调节。自噬流和内吞流是细胞进行信号传递和物质运输的两条关键途径,对细胞稳态、信号转导和细胞免疫至关重要。目前用于监测自噬流和内吞流的荧光探针大多是通过对p H值变化和极性转变的检测间接实现对内吞流和自噬流的监测。基于此设计的荧光探针对细胞微环境变化高度敏感,使得其成像性能缺乏足够的稳定性。生物正交点击反应是典型的双组分反应,可以在生理条件下特异且高效地进行。点击化学的出现为荧光探针的设计提供了另一种新的思路-荧光淬灭的探针发生生物正交点击反应后恢复荧光。在已有的生物正交反应中,与四嗪共轭的荧光团和反式-环辛烯醇（TCO）之间的发生的逆电子需求的狄尔斯-阿尔德（i EDDA）环加成反应具有优越的反应动力学、高生物相容性和高响应倍比等优势。本课题基于四嗪与反式-环辛烯醇之间的特异性i EDDA反应,设计了两组能够在特定细胞器富集的点击探针,以实现对内吞流和自噬流的荧光成像。具体内容如下:（1）对线粒体自噬的检测:通过氨基哌嗪将反式-环辛烯醇和罗丹明B连接起来,组成能够靶向溶酶体且对酸性p H值敏感的探针Lyso-Rh B-TCO,当探针特异性靶向到溶酶体时会发出红色的荧光;再将Bodipy与四嗪共轭连接,四嗪与荧光团发生荧光共振能量转移淬灭荧光;以三苯基膦作为靶向基团实现探针Mito-Tz-BDP的线粒体靶向。正常情况下探针Lyso-Rh B-TCO在溶酶体富集发出红色荧光,探针Mito-Tz-BDP聚集在线粒体但是没有荧光信号;当线粒体自噬发生时,线粒体自噬体与溶酶体融合,两个探针发生i EDDA反应,四嗪结构被破坏,Bodipy的绿色荧光恢复,实现了自噬流的检测。实验表明探针Lyso-Rh B-TCO能够对自噬流进行高对比度的荧光成像,并实现了线粒体自噬体与溶酶体特异性融合的荧光成像,为疾病诊断和自噬流的研究提供了可靠成像方法;（2）对内吞流的检测:利用胆固醇分子的质膜锚定作用实现探针Mem-Tz-Rh的质膜富集;四嗪与罗丹明结构的共轭连接使得探针中的荧光被淬灭。化合物Lyso-TCO结构中修饰的吗啉环,使化合物在溶酶体中富集。正常生理条件下,探针Mem-Tz-Rh富集在细胞膜上,Lyso-TCO在溶酶体中富集,此时没有荧光信号;当内吞发生时,质膜凹陷形成内囊体,最后与溶酶体发生融合,使得化合物Lyso-TCO和探针Mem-Tz-Rh相遇并发生逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应,激活探针的红色荧光,从而实现了对细胞内吞过程中内含体与溶酶体融合过程的“off-on”型荧光检测。实验结果显示探针Mem-Tz-Rh具有高选择性、高生物相容性等优点,对He La细胞的实时成像证实了该探针的设计理念对活细胞成像具有极好的应用前景。
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