目的　　 Aurora激酶是进化上保守的丝、苏氨酸激酶，对细胞周期事件起重要调节作用。在体细胞中，Aurora激酶B(AURKB)作为染色体乘客蛋白复合物的成员之一，在细胞有丝分裂后期定位于中间体，末期则主要转向有丝分裂桥。AURKB的功能与Aurora激酶A(AURKA)不同，这与两者亚细胞定位是相关的。AURKA主要参与中心体功能，有丝分裂启动及纺锤体组装调控，而AURKB则负责染色质塑造，微管与着丝粒粘附，纺锤体检查点和胞质分裂[1]。Aurora激酶在许多肿瘤细胞系中过表达，提示其在肿瘤发生中发挥重要作用。目前Aurora激酶已成为肿瘤诊断和治疗的潜在靶点。近年来对Aurora激酶在生殖发育领域的研究已初见端倪。有研究发现减数分裂未成熟的小鼠卵母细胞中包含3种Aurora激酶亚型的转录本，转录水平在整个减数分裂期间维持稳定，且AURKA是主要表达亚型。对Aurora激酶的抑制导致进入MII（第二次减数分裂中期）的细胞减少和染色质重塑缺陷。AURKA过表达导致中心体扩增甚至多倍体形成。而AURKB过表达导致染色体无法正确排列[2’3]。这些研究使得我们提出疑问：减数分裂成熟的卵母细胞受精后，由于细胞命运发生重大变化，Aurora激酶的表达与定位情况将如何？它们在受精卵的有丝分裂中发挥怎样的作用?在体细胞中，Aurora激酶已公认为有丝分裂的重要调节者，然而在哺乳动物胚胎发育中的作用仍鲜为人知。　　 众所周知，丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)级联行驶重要的细胞内功能。在孕酮诱导爪蟾卵母细胞成熟研究中，Eg2激酶，爪蟾特有的Aurora激酶家族成员，能激活MAPK途径[4]。该研究提出了Aurora激酶通过MAPK途径参与信号转导调节的可能性。另外，Gigoux等报道称AURKA通过与RasGTP酶激活蛋白相互作用而降低自身激酶活性，而后者是Ras的负调控因子[5]。Tseng等认为野生型AURKA加强了Ras突变转化细胞的集落形成及侵袭能力，是通过Ras/MEK/ERK信号通路介导的[6]。关于AURKB和MAPK的关系研究，Kanda等的研究表明AURKB的激酶活性受Ras调节[7]。Eves等证明Raf激酶抑制蛋白（RKIP）的缺失通过对Raf/MEK/ERK1，2的活化抑制AURKB[8]。而Kosik等人声称Aurora激酶并非Ras-MAPK途径的直接作用因子，该激酶的活性不是该通路必须的[们。Maton等在卵母细胞的研究中证明AURKA的激活独立于MAPK途径[10]。哺乳动物中，MAPK成员包括细胞外调节激酶1和2(ERK1，ERK2)。Mos，MAPK和MAPK的底物参与小鼠卵母细胞纺锤体动力及第一极体释放调节[11，12]。Maekawa等证明了ERK对2-细胞到8-细胞期胚胎的重要作用[13]。然而，关于MAPK和Aurora激酶在小鼠早期胚胎发育中如何相互作用还未见报道。探讨Aurora激酶能否作为MAPK的下游底物或上游调节因子来发挥诸如纺锤体形成、染色质分离、胞质分裂的调节作用，对于进一步阐明这些基因对细胞周期事件的调控是有意义的。我们的研究目的在于建立Aurora激酶A、B在小鼠受精卵第一次卵裂进程中表达模式的基础上，探讨其中的一个主要表达亚型-AURKB的作用及可能存在的MAPK信号通路。　　 方法：　　 1、小鼠超排卵及1-细胞期G1，S，G2，M四个时相受精卵的收集。　　 2、运用real-time RT-PCR及western blot检测Aurora激酶A、B在1-细胞期受精卵四时相的mRNA及蛋白表达，确定高表达的时相及亚型。　　 3、运用免疫细胞化学方法观察主要表达亚型AURKB的亚细胞定位。　　 4、构建针对AURKB的shRNA表达载体，运用显微注射技术导入小鼠G1期受精卵，收集各时相受精卵，从mRNA、蛋白水平上验证是否打靶成功。　　 5、确定干扰Aurora激酶B表达后，运用免疫荧光法观察各时相受精卵微管与染色质，相差显微镜下统计异常卵裂率、死亡率等的改变。　　 6、获取小鼠G1期受精卵后，在MEK特异性抑制剂U0126下体外培养至对照组AURKB高表达的时相，相差显微镜下观察细胞形态改变，统计异常卵裂率。　　 7、收集MEK抑制剂下体外培养受精卵至对照组AURKB高表达时相，运用western b1ot及放射自显影法检测AURKB的表达及活性变化。　　 8、免疫荧光法观察AURKB分别与磷酸化ERK1/2的共定位情况。　　 结果：　　 1、Aurora激酶A、B在小鼠受精卵第一次有丝分裂四个时相的表达　　 Aurora激酶A、B的mRNA及蛋白表达水平从G1期开始增加，至M期达到峰值。其中G1至G2期AURKA表达丰度稍强于AURKB，但两者差异并不显著，进入M期后AURKB则成为主要的表达亚型。　　 2、Aurora激酶B在小鼠受精卵第一次有丝分裂四个时相的定位　　 AURKB在G1、S期主要分布在胞浆，核中几无表达；G2期时则更密集地与染色质相关联；进入M期后在整个细胞中广泛分布，并向细胞膜移动。　　 3、Aurkb的shRNA表达载体敲低Aurora激酶B的表达　　 将构建成功的shRNA表达载体以显微注射方式直接导入G1期受精卵的雄原核，经过33小时的培养后检测到1mg/m1的质粒浓度可较充分地抑制内源性AURKB的mRNA及蛋白表达。　　 4、Aurora激酶B表达敲低对小鼠受精卵第一次有丝分裂的影响　　 Aurkb基因敲低的大部分受精卵虽然进入M期，但伴随着不正常的分裂形态，少部分受精卵阻滞于G2期而无法正常进入有丝分裂。　　 5、ERK1/2蛋白在小鼠受精卵四个时相中的表达　　 ERK1/2总蛋白在G1/S期为低表达，G2/M期则表达升高。其磷酸化程度在M期时达到最高水平。　　 6、MEK抑制剂对小鼠受精卵分裂的调控　　 采用30μM的MEK特异性抑制剂U0126可较充分地抑制内源性ERK1/2活性，采用该浓度处理G1期受精卵15个小时，可导致80％以上的受精卵出现分裂异常，多表现为不等大的两个子细胞或三个子细胞等不对称分裂形态。　　 7、抑制MEK-ERK通路对Aurora激酶B表达与活性的影响　　 U0126抑制ERK1/2的磷酸化后可导致AURKB的蛋白表达下调，以组蛋白H3为底物测定的激酶活性下降。　　 8、MEK抑制剂分别对磷酸化ERK1/2与Aurora激酶B共定位的影响　　 对照组的M期受精卵中，磷酸化的ERK1/2与AURKB共同定位于细胞核和细胞质。MER抑制剂处理后细胞核中磷酸化的ERK1/2与AURKB表达均不同程度下降。　　 结论：　　 1、Aurora激酶A、B在小鼠受精卵第一次有丝分裂G1，S，G2，M四个时相均表达，其中G1、S期共为两个激酶的低表达期，G2、M期共为高表达、稳定表达期，进入M期后，AURKB成为主要表达的亚型。　　 2、AURKB的定位呈细胞周期依赖性，在细胞核及细胞质均有表达。　　 3、AURKB表达沉默妨碍受精卵正确的染色体分离及胞质分裂。　　 4、小鼠受精卵第一次卵裂过程中的ERK1/2总蛋白及磷酸化水平在M期达峰值。对其活性的抑制将导致异常卵裂率增高。　　 5、ERK1/2活性的抑制下调AURKB的蛋白表达及激酶活性，提示AURKB可能参与MAPK途径调节。