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目的炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）是严重影响人类生活质量和经济负担的肠道非特异性炎症性疾病。胶质细胞源性神经营养因子（glial cells derived neurotrophic factor,GDNF）不仅可以维护肠神经系统的完整性,还具有促进肠上皮细胞成熟及调节肠道免疫反应等作用。最新研究证实,肠平滑肌细胞（intestinal smooth muscle cells,ISMC）是炎症过程中GDNF的主要来源,而慢性炎症下ISMC肥大增生并合成胶原纤维促进了肠道狭窄形成。ISMC来源的GDNF在IBD中的作用尚无研究。原代ISMC的体外培养具有耗时、耗力及传代次数有限等缺点,导致其体外研究受限。本研究通过建立永生化大鼠ISMC系,探讨ISMC来源的GDNF对肠上皮紧密连接及平滑肌表型转化的作用。方法首先,采用含猴病毒40大T抗原（simian virus 40 large T antigen,SV40LT）基因的慢病毒载体转染原代培养的新生大鼠ISMC,经抗生素筛选并挑选单克隆后获得永生化ISMC。验证永生化细胞内Sv40lt DNA和m RNA,分别检测不同传代批次细胞中α-SMA及desmin的表达差异及高传代细胞增殖能力和对卡巴胆碱的反应。利用慢病毒和睡美人转座系统转两种方式转染荧光素酶基因Luc2至永生化ISMC,小动物活体成像动态检测皮下注射永生化ISMC后小鼠体内荧光信号。其次,使用不同浓度肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）、白介素1β（interleukin 1β,IL-1β）及γ干扰素（interferon,IFN-γ）作用ISMC,检测ISMC培养上清中GDNF分泌量。此外,利用基因工程技术在上述永生化ISMC中过表达Gdnf基因,分别取GDNF过表达及对照细胞培养上清培养肠上皮细胞系IEC-6,检测细胞增殖、跨上皮电阻率（trans-epithelial electrical resistance,TEER）和紧密连接蛋白ZO-1、E-cadherin及occludin的表达水平;建立TNF-α诱导的肠上皮紧密连接损害模型,检测过表达GDNF的ISMC培养上清对IEC-6细胞TEER及紧密连接蛋白ZO-1和occludin的影响,加入GDNF受体Ret抑制剂vandetanib后检测TEER变化。最后,检测过表达GDNF后ISMC的增殖、迁移、合成能力及收缩蛋白SMMHC、α-SMA、SM22及calponin的表达水平,加入vandetanib后检测上述指标变化。检测过表达GDNF后ISMC细胞内p-AKT及p-ERK1/2蛋白的变化,加入vandetanib后检测p-AKT及p-ERK1/2蛋白的变化。结果本实验成功建立了永生化大鼠ISMC系,该细胞系形态与原代ISMC类似,表达平滑肌标志物α-SMA和desmin。永生化ISMC内可以检测到Sv40lt基因的表达,目前已稳定传代至50余代,且不同传代批次细胞对α-SMA和desmin的表达无明显差异;多次传代的永生化ISMC仍有较强的增殖能力和对卡巴胆碱的反应;小动物活体成像证实永生化ISMC无成瘤特性。不同浓度的TNF-α、IL-1β和IFN-γ作用ISMC,仅TNF-α能促进ISMC-Hc分泌GDNF,且TNF-α促进ISMC分泌GDNF具有时间和浓度依赖性。ISMC来源的GDNF促进IEC-6增殖,增加TEER及ZO-1、E-cadherin及occludin的表达;ISMC来源的GDNF能部分恢复TNF-α所致的TEER及ZO-1、occludin水平的降低,而vandetanib能使TEER恢复至基线水平;过表达GDNF后,ISMC增殖能力及迁移能力增强,胶原蛋白Ⅰ和骨桥蛋白的表达增加,而收缩蛋白SMMHC、α-SMA、SM22及calponin表达水平降低,而vandetanib能使过表达GDNF的ISMC增殖及迁移能力减弱,而SMMHC、α-SMA、SM22及calponin表达水平升高。过表达GDNF后ISMC细胞内p-AKT及p-ERK水平升高,vandetanib能使过表达GDNF的ISMC细胞p-AKT及p-ERK水平减低。结论TNF-α促进ISMC分泌GDNF,ISMC来源的GDNF具有促进肠上皮紧密连接形成和调控自身表型转化的作用。