鲆鲽鱼类在形态学分类上隶属鲽形目。其中,半滑舌鳎是我国特有的,温水性近海营底栖生活的海水鱼类,主要分布于我国渤海、黄海等沿海地区,在我国具有极高经济价值和较高的科学研究价值。为了更好的适应底栖生活方式,半滑舌鳎进化发展成为一种具有内脏小,运动少,生长快,占用较少的水体生活空间等生物学特性的鲆鲽鱼类,加之其肉味鲜美,口感爽滑,蛋白质含量高,营养丰富,市场价格高,经济效益好等特点,深受广大海水养殖者的喜爱,成为我国海水养殖的重要经济鱼类。哈维氏弧菌是半滑舌鳎养殖过程中细菌病的主要病原之一,严重影响了半滑舌鳎的经济价值并阻碍了半滑舌鳎养殖业的发展。本论文主要通过对半滑舌鳎抗哈维氏弧菌病相关基因座进行定位,对免疫相关基因进行初步筛选及对免疫相关基因进行初步功能研究,以期为解析半滑舌鳎抗病机制提供研究基础。1.半滑舌鳎抗哈维氏弧菌病QTL定位及抗病免疫相关基因筛选为了方便筛选到与抗病免疫相关的候选基因,在实验室之前的研究基础上,对17号染色体(LG18连锁群)已经定位到的抗哈维氏弧菌病相关区间qE进行加密,在半滑舌鳎加密后的整合(LG18)、雌性(LG18F)、雄性(LG18M)连锁群上定位到11个免疫相关基因座,使得抗病相关区间从原先的7.6 Mb缩小到5.6 Mb。将加密后的区间比对到基因组上,发现其中包含311个推定基因。在GO功能富集过程中共富集到13个相关GO term;在KEGG分析中发现5个与免疫相关通路;最终,结合基因功能分类筛选到12个抗病免疫候选基因,并在后续实验中将对其中2个基因(dctn5和stat5bl)进行了深入的研究。以上结果为半滑舌鳎抗哈维氏弧菌病的深入研究提供了数据基础。2.半滑舌鳎dctn5基因的克隆和特征分析,及dctn5 tv1在免疫应答反应中的功能初步分析为了探索dctn5在半滑舌鳎免疫应答反应中的功能,本试验克隆和鉴定了半滑舌鳎两个cdtn5转录本(分别命名为dctn5_tv1 and dctn5_tv2)的全长cDNA。这两个变体是通过可变剪切第一和第二个外显子而产生的。不同组织的qRT-PCR检测结果显示dctn5_tv1在免疫相关组织中广泛表达,而dctn5_tv2主要在性腺中表达。基于这些,推测dctn5 tv1参与了半滑舌鳎免疫应答反应。因此,检测了在哈维氏弧菌感染后的dctn5_tv1的mRNA表达水平,结果显示在半滑舌鳎鳃、肠、脾、肾、皮肤中dctn5_tv1 mRNA表达水平显著上调,为dctn5 tv1参与半滑舌鳎免疫应答提供了证据。此外,成功重组表达了 Dctn5_tv1蛋白并检测了其体外抗菌活性,结果表明Dctn5_tv1对大肠杆菌、无乳链球菌、副溶血弧菌、希瓦氏菌和哈维氏弧菌具有不同的抑菌活性,而对革兰氏阳性菌(无乳链球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)具有较高的体外抑菌活性。重组蛋白Dctn5_tv1在体外与细菌的结合试验结果显示Dctn5_tv1能够在体外与细菌细胞结合,暗示Dctn5_tv1的抗微生物活性可能在与细菌细胞结合后起作用。为探索dctn5在半滑舌鳎抗病中的机制提供了研究基础。3.半滑舌鳎stat5bl基因的克隆、鉴定及在免疫应答反应中的表达模式分析为了分析stat5bl在半滑舌鳎免疫应答反应中的作用,本试验克隆和鉴定了stat5bl全长cDNA。在氨基酸序列的多重比对中,硬骨鱼类中的stat5bl和stat5b基因的氨基酸序列相似性较高。此外,在进化分析中发现在硬骨鱼类中stat5bl和stat5b聚为同一个分支,因此推测在硬骨鱼类中stat5bl和stat5b是同一个基因。使用qRT-PCR检测了其在半滑舌鳎不同组织中的表达分布,结果显示stat5bl mRNA在免疫相关组织肝脏、鳃、皮肤高表达,因此推测stat5bl可能参与了半滑舌鳎抗病免疫反应。为了验证stat5bl在半滑舌鳎免疫应答反应中的作用,检测了哈维氏弧菌感染后stat5bl在免疫相关组织中的表达情况,结果显示stat5bl mRNA在肾脏、鳃、肠、皮肤中均出现上调表达,为stat5bl参与半滑舌鳎免疫应答反应中的推测提供了证据。stat5bl基因在肝细胞中敲降后,对Jak-STAT信号通路上的免疫相关基因的表达产生了相应调控作用。初步阐明了sta5bl基因在半滑舌鳎免疫应答反应中的作用。4.半滑舌鳎r-spondin家族新成员(rspo2l)的分子特征、表达及功能初步分析除了对通过QTL定位筛选的免疫相关基因进行功能研究外,还对本实验室通过转录组分析和文献查阅筛选到的R-spondins家族中rspo2l基因进行了相关的功能研究,我们克隆和鉴定了半滑舌鳎r-spondin家族新成员rspo2l全长cDNA。进化分析表明,rspo2l和rspo2分别各聚为一支,暗示raspo2l和rspo2具有不同的进化地位,进一步说明rspo2l和rspo2是两个独立的基因。在不同组织中rspo2l表达模式结果显示,rspo2l mRNA主要高表达于鳃、皮肤、肝脏中,在其它组织中表达较低。此外,还检测了哈维氏弧菌感染后半滑舌鳎免疫相关组织中rspo2l和其下游基因β-catenin的表达水平,结果显示,rspo2l mRNA在鳃,皮肤,脾脏,肾脏均是上调表达,而在肝脏中是下调表达。此外,下游基因β-catenin的表达趋势与rspo2l的相似,暗示rspo2l与Wnt/β-catenin信号通路可能存在一定关联。此外,成功重组表达了 Rspo21蛋白并检测了其体外的抗菌活性,结果表明Rspo21在体外对大肠杆菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌均没有明显的抑菌活性。基于以上结果,我们推测Rspo21不是直接参与了半滑舌鳎的抗病免疫反应而可能是通过调控Wnt/β-catenin信号通路参与了半滑舌鳎的免疫反应。这些初始结果推动了半滑舌鳎免疫应答反应中rspo2l的功能研究。