肿瘤是机体在各种致癌因素作用下,局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控,导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。我国是世界第一癌症大国,癌症是第二大致死性疾病,仅次于心血管疾病。Raf激酶(Rapidly Accelerated Fibrosarcoma)是逆转录病毒致癌基因,Raf激酶有三种亚型,分别为A-Raf, B-Raf和C-Raf。 Raf激酶的突变是细胞癌变的主要原因之一,A-Raf突变可导致卵巢癌和大肠癌,B-Raf突变和神经系统癌变、皮肤癌和胸腺癌相关,C-Raf突变和小细胞肺癌相关,因此,调控Raf激酶也就成为了治疗癌症的最主要手段之一。细胞周期(cell cycle)是一个细胞通过生长,分成两个细胞的全过程,即细胞从分裂结束到下一次分裂结束所经过的所有过程。细胞的周期受机体调节系统的影响。但是肿瘤细胞,由于宿主失去对它的调控,因而恶性增殖。细胞周期的紊乱,细胞的不正常增殖都可能引发细胞癌变,细胞周期的调控系统的每一个方面都有可能是导致细胞癌变的主要因素。调控细胞周期可分为外源性和内源性调控,其中外源性是因为细胞因子或者其他外界刺激引起。内源性主要是通过细胞周期蛋白(cyclin),细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK),细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDIs)等周期蛋白的网络调控来实现。大多数癌症治疗方法将注意力集中于单个靶点或单个突变,缺乏从系统的高度认识问题和对分子互作网络的了解,更缺乏对动态的细胞信号网络的了解。我们从蛋白相互作用网络入手,深入理解和认识肿瘤细胞信号网络的关键节点在肿瘤发生中的作用。近年来,质谱技术应用得到了迅猛的发展,本研究利用蛋白互组,质谱的高通量来系统性识别C-Raf的相互作用蛋白,又由于Raf激酶的突变是细胞癌变的主要原因之一。我们构建C-Raf突变体,比较野生型与突变型的结合蛋白的差异,尤其是周期蛋白将有利于初步解决上述问题。为了找到C-Raf的相互作用周期蛋白,我们在Flp-InT-RexHEK 293细胞中稳定表达带VSV标签的C-Raf (VSV-C-Raf)。随后利用VSV beads在这些细胞系中进行了免疫沉淀实验。我们同时在Flp-InT-RexHEK 293细胞中里稳定表达了突变体VSV-C-Rafs247G。扩大了Flp-InT-RexHEK 293-VSV-C-Raf的免疫沉淀规模。分别在Flp-InT-RexHEK 293-VSV-con和Flp-InT-RexHEK 293-VSV-C-Raf野生型与突变型细胞中进行了大规模的IP实验。通过三次质谱结果,我们得到了86个周期蛋白。另外我们用string tool绘制了结合蛋白网络图,C-RafWT和C-RafS247G共有162个共同的结合蛋白。其中有11个蛋白与C-RafWT结合不与C-RafS247G结合。还有8个蛋白能与C-RafS247G结合而不与C-RafwT结合。随后我们挑选了MSSl和SMC3蛋白,对这两种蛋白的抗体进行了Western Blot的验证。结果显示,这些抗体都能在C-Raf免疫沉淀物里得到阳性的信号,从而验证这些相互作用蛋白的真实性。进一步证明MSS1和SMC3能与C-Raf结合。SMC3是黏连蛋白重要组成部分。由SMC1, SMC3, AD21和STAG组成的多亚基复合粘连蛋白可形成一种环结构,这种环结构被认为包围姐妹染色体从而介导姐妹染色体粘连蛋白,并在基因调控中发挥关键作用。染色体凝聚的复合物在细胞周期后期被切割,并且解离染色质,凝聚耦合到DNA复制并参与DNA修复。SMC3在S期可以被乙酰化,建立染色质加载的粘连蛋白的粘着性。MSS1是AAA+ATP酶家族的一个含有433个氨基酸的成员。细胞周期各个时相的过渡需要细胞周期蛋白和其他蛋白质的降解泛素化途径与细胞周期有着十分密切的关系。细胞周期进程是由一系列CDK来进行调控的,而CDK则是由cyclin来激活。在CDK-cyclin复合物行使了它的功能之后,复合物中的cyclin就会被多泛素化并由蛋白酶体降解,从而保证了细胞周期的正常运转。而MSS1能降解细胞周期蛋白细胞周期依赖激酶抑制蛋白等天然蛋白质是细胞周期调控的基础。总之,我们首先成功构建C-Raf以及突变体稳定细胞系,通过蛋白质互作,免疫沉淀法以及多维蛋白质鉴定技术。系统鉴定了C-Raf的相互作用蛋白和周期蛋白。为我们今后研究他们在癌症研究中以调节细胞周期为策略治疗肿瘤提供基础。