研究背景乳腺癌（Breast Cancer,BC）作为全球女性最常见的恶性肿瘤,严重威胁着女性的身心健康,已成为威胁家庭和社会和谐的重大公共卫生事件。据世界卫生组织WHO最新统计数据显示,2012年全球女性新发乳腺癌病例数超过167万,占女性新发癌症的25.2%,仅我国新发病例数就超过18万,占世界乳腺癌新发病例数1.17%。近年来,随着乳腺癌预防手段、治疗措施的不断提高,乳腺癌患者的预后也得到了一定的改善。2012年发展中国家乳腺癌死亡病例数为32万,占全癌症死亡原因的14.3%,乳腺癌仍然高居发展中国家癌症死亡原因的首位；在发达国家,仅次于肺癌居全癌症死亡原因的第2位。因此,尽管乳腺癌分型已较为完备,治疗策略亦比较规范,仍有一部分患者的治疗效果欠佳,这可能与肿瘤异质性及机体免疫状态等诸多因素有关。肿瘤异质性对治疗效果的影响已被广泛认可。近来,在恶性肿瘤发生、发展过程中一直发挥作用的机体免疫状态研究引起了大家的兴趣,机体免疫状态对恶性肿瘤治疗反应的影响逐渐成为当前研究的热点。因此,本研究通过对前期全人类基因组表达谱芯片结果进行分析,对比7对乳腺癌组织与其自身正常组织以及7对乳腺癌组织与良性病变组织的基因表达谱,对差异表达基因进行功能分类,寻找免疫相关基因,文献检索分析基因已有功能,确定IFI30为兴趣基因。芯片结果示：IFI30mRNA在乳腺癌组织中表达明显高于其自身正常组织及良性病变组织,提示IFI30基因可能与乳腺癌存在相关性。人IFI30基因,表达产物为IFN-γ诱导溶酶体巯基还原酶（gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase,GILT）,是目前唯一已知定位于溶酶体、吞噬体内的巯基还原酶,最适PH为4.5-5.5,是该家族中唯一一种在酸性环境中起作用的酶。GILT在专职抗原递呈细胞（APC）中组成性表达,在其他细胞中可被一些炎症因子（如IL-1β、TNF-α及IFN-γ等）诱导表达或表达上调。GILT的主要功能是催化蛋白质二硫键的还原。一方面,GILT可促进MHC-Ⅱ类分子限制性抗原的递呈,从而影响CD4+T细胞的活化；另一方面,促进CD8+T细胞识别MHC-Ⅰ类分子限制性抗原,参与机体的抗病毒及肿瘤免疫应答反应。已有研究证实,GILT在肿瘤细胞中低表达或表达缺失,直接影响其表面抗原向T细胞的递呈过程,给予IFN-γ干预可诱导其表达上调,提高机体抗肿瘤免疫应答。GILT在恶性肿瘤（如黑色素瘤、前列腺癌及胶质瘤等）免疫应答中发挥了不可或缺的作用。越来越多的证据表明GILT参与肿瘤免疫应答过程,但其在乳腺癌中的作用及机制尚不明确。基于以上背景,本研究拟通过对GILT在乳腺癌中表达的临床意义及作用进行研究,以期发现GILT在乳腺癌中的应用价值,为后续基于GILT的乳腺癌肿瘤免疫研究提供一些参考。第一部分GILT蛋白与乳腺癌的相关性研究目的本研究通过对前期全人类基因组表达谱芯片结果进行分析,对比7对乳腺癌组织与其自身正常组织以及7对乳腺癌组织与良性病变组织的基因表达谱,对差异表达基因进行功能分类,寻找免疫相关基因,文献检索分析基因已有功能,确定IFI30为兴趣基因。芯片结果示：IFI30mRNA在乳腺癌组织中表达明显高于自身正常组织及良性病变组织,提示IFI30基因可能与乳腺癌存在相关性。因此,本研究拟通过检测19例乳腺癌患者癌组织及其正常组织中IFI30mRNA及其表达产物GILT蛋白的表达情况,对芯片结果进行验证；进而在44例存在淋巴结转移的乳腺癌患者中研究乳腺癌转移灶及原发灶相对自身正常组织GILT的表达变化,明确该基因与乳腺癌的相关性,为进一步研究GILT在乳腺癌中的临床意义及作用奠定基础。研究方法1.全人类基因组芯片结果分析通过对比分析乳腺癌组织（n=7）与自身正常组织（n=7）、乳腺癌组织（n=7）与良性病变组织（n=7）的差异表达基因,寻找新的癌症相关基因,并通过PubMed数据库进行相关文献检索,总结分析基因已有功能,筛选免疫相关基因,确定兴趣基因。2.激光捕获显微切割技术（LCM）获取同一患者乳腺癌细胞及正常乳腺上皮细胞收集2011年12月——2012年6月期间在山东大学第二医院乳腺外科行乳腺癌改良根治术乳腺癌患者新鲜肿瘤组织及正常乳腺组织,术前未行任何治疗,组织离体半小时内完成标本留取,编号后置于液氮保存；对肿瘤及正常组织行冰冻组织切片,LCM染色试剂盒染色,利用LCM技术,排除乳腺肿瘤组织中细胞异质性影响,分别收集19例患者的癌细胞及其正常乳腺上皮细胞,溶于200μlQIAzol溶剂,-80℃保存。3.Real-time PGR检测mRNA水平统一抽提癌细胞及正常乳腺上皮细胞总RNA,紫外分光光度计检测总RNA纯度,通过逆转录及实时荧光定量PCR技术对cDNA进行扩增,检测癌细胞及正常乳腺上皮细胞IFI30mRNA表达情况。4.免疫组化检测GILT蛋白水平收集上述19例入组患者的组织样本蜡块,均经山东大学第二医院病理科医生对其进行HE染色切片复核与组织定位,挑选最具有代表性的乳腺癌组织及癌旁正常组织蜡块。对入组的19例乳腺癌患者的癌组织及癌旁正常组织进行石蜡组织切片,行GILT蛋白常规免疫组织化学染色。利用ImagePro_Plus_IPP软件通过平均光密度测定GILT的表达量,同时通过两名病理科专家以“背靠背”方式对染色结果进行评定,确定GILT染色的强度及范围得分。5.免疫组织化学法分析正常乳腺上皮-原发灶-淋巴结转移灶GILT表达收集2005年1月——2010年6月期间在山东大学第二医院行乳房切除、且腋窝淋巴结转移阳性的44例乳腺癌患者信息及石蜡组织切片。对44组正常乳腺组织-原发灶-淋巴结转移灶分别进行GILT免疫组织化学染色。免疫组织化学染色方法及判定方法同前。6.统计学分析用SAS9.1.3软件包对数据进行统计学处理,real-time PCR及IPP软件分析的结果以均数±标准差表示,两均数间比较用t检验；利用卡方检验对乳腺癌组织与正常乳腺组织中GILT表达差异进行统计学分析,所有检验结果均为双侧,P<0.05认为有显著性统计学差异。结果1.确定IFI30为兴趣基因对比7对乳腺癌组织——自身正常乳腺组织、7对癌组织——良性病变组织差异表达基因发现：IFI30mRNA水平在两组比较中均有显著性差异。芯片结果显示：该基因癌组织中mRNA水平是正常乳腺组织的5.4016倍（P<0.001）是良性病变组织的6.6383倍（P<0.05）,表明该基因可能与乳腺癌存在一定的相关性。因此,我们确定IFI30为兴趣基因。2.乳腺癌细胞IFI30mRNA水平较自身正常乳腺上皮细胞显著升高利用激光捕获显微切割技术（LCM）从每张切片上获取的细胞数目为5000-7000个细胞。提取总RNA紫外分光光度计测定A260/A280的比值均在1.9-2.1之间,总RNA纯度较好。普通PCR及琼脂糖电泳定性检测基因的扩增产物,内参基因扩增片段长度为205bp,目的基因扩增片段长度为142bp,明确乳腺组织中确实表达IFI30基因。real-time PCR检测IFI30mRNA表达水平,结果显示：乳腺癌细胞IFI30mRNA水平明显高于自身正常乳腺上皮细胞,前者为后者的2,18倍（P=0.0427）,即在正常乳腺上皮细胞到乳腺癌细胞的转变过程中,IFI30mRNA表达上调。3.乳腺癌组织GILT蛋白水平较自身正常组织降低上述19例患者的石蜡组织切片行免疫组织化学染色,结果显示：GILT蛋白主要表达于细胞浆中,在正常乳腺上皮细胞、乳腺癌细胞及间质细胞中均有表达。并且乳腺癌组织中可见大量存在于细胞外（如乳腺导管管腔）的GILT蛋白染色,而在正常组织中少见。3.1IPP软件分析结果19对乳腺癌组织——正常乳腺上皮组织中,GILT表达情况经IPP软件分析的结果显示：乳腺癌组织中GILT染色强度及染色密度较弱,其平均光密度（density mean）值为0.03659±0.0084,而正常乳腺上皮组织中GILT染色强度及密度均较乳腺癌组织强,平均光密度值为0.0512±0.0118,两组GILT表达量之间的差异具有统计学意义（P=0.002）,即乳腺癌组织中GILT的表达量明显低于其周围正常乳腺组织。3.2免疫组织化学染色病理学评分结果病理科专家根据改良的Harvey评分标准评价GILT免疫组化特异性染色结果,显示：乳腺癌组织中存在GILT蛋白表达缺失的情况,蛋白阴性率为21.05%（4/19）,而正常乳腺组织中均有GILT的表达。乳腺癌中GILT免疫组化染色的强度得分（P=0.006）较正常乳腺上皮明显降低,而范围（P=0.062）和总分（P=0.062）两组间无统计学差异。以上结果表明：在正常乳腺上皮到乳腺癌的转变过程中,GILT蛋白表达水平下调。4.乳腺癌原发灶与淋巴结转移灶中GILT蛋白表达均较自身正常组织明显降低44例腋窝淋巴结转移乳腺癌患者的正常组织——原发灶——淋巴结转移灶的免疫组织化学染色结果显示：乳腺癌原发灶、淋巴结转移灶及正常组织中GILT蛋白的表达强度（P=0.005）、范围（P=0.025）及总分（P=0.008）均存在显著性差异。进一步分析发现,乳腺癌原发灶中GILT蛋白表达强度（P=0.002）、范围（P=0.012）及总分（P=0.003）均较正常组织显著降低,淋巴结转移灶中GILT蛋白表达强度（P=0.031）、范围（P=0.039）均较正常组织显著降低,表明GILT可能参与了乳腺癌疾病发生与发展过程。上述研究结果表明：GILT与乳腺癌存在相关性,可能参与了乳腺癌发生与发展过程。结论1.乳腺癌组织中IFI30mRNA水平明显高于自身正常组织,在正常乳腺上皮细胞到乳腺癌细胞的转变过程中IFI30mRNA表达上调。2.乳腺癌原发灶与转移灶中GILT表达明显低于自身正常组织,在正常乳腺上皮细胞到乳腺癌细胞的转变过程中GILT表达水平下调。3.GILT与乳腺癌存在相关性,可能参与乳腺癌疾病发生与发展过程。第二部分GILT在乳腺癌中的临床意义及作用研究目的通过大量临床生物样本（包括乳腺癌组织及癌旁正常组织）GILT蛋白表达情况的检测,进一步明确乳腺组织中GILT蛋白表达情况；收集患者的临床诊疗、病理信息及预后随访信息,通过对不同GILT蛋白表达水平的患者进行生存分析,明确GILT表达状况对乳腺癌患者预后的影响；研究GILT与常见临床病理因素的关系,分析其在乳腺癌中的作用；通过多因素分析进一步明确GILT作为独立预后指标的价值；另外,越来越多的证据表明,肿瘤微环境中的Treg抑制局部抗肿瘤免疫应答反应,在免疫逃逸过程中发挥了重要作用,而FOXP3是CD4+CD25+调节性T细胞最为特异的标志物之一,因此通过进一步研究存在腋窝淋巴结转移的乳腺癌患者正常组织——原发灶——淋巴结转移灶中GILT表达与间质FOXP3+淋巴细胞比例的相关性,探讨乳腺癌发生与发展过程中GILT蛋白表达情况与免疫逃逸的相关性。研究方法1.免疫组化法分析218例乳腺癌与99例正常组织GILT的表达情况收集2007年1月—2008年12月期间在山东大学第二医院、临沂市人民医院及临沂市肿瘤医院行乳腺癌改良根治术患者肿瘤组织切片218例,正常组织切片99例。入组患者组织切片均由所在医院病理科医生对其进行HE染色切片复核与组织定位,挑选最具有代表性的乳腺癌组织及正常组织蜡块。对218例乳腺癌组织及99例正常组织进行GILT常规免疫组织化学染色。由两名病理科专家以“背靠背”方式对染色结果进行评定,确定GILT染色的强度及范围得分。2.乳腺癌患者GILT表达情况与临床、病理参数之间的相关性单因素分析乳腺癌组织中GILT的表达情况与患者的临床、病理特点及各种不同治疗方式（包括手术方式、化疗方案、放疗与否及内分泌治疗情况等）之间的相关性。常见临床病理特点包括：（一）一般情况：年龄、体重指数（body mass index,BMI）、初潮年龄、月经状态；（二）疾病史：高血压、糖尿病；（三）临床参数：患侧、外周血白细胞计数、外周血中性粒细胞计数、外周血淋巴细胞计数、外周血血红蛋白；（四）病理特点：组织学类型、肿瘤大小、腋窝淋巴结状态、病理TNM分期、激素受体状态（ER、PR）、HER2、Ki67、分子分型、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）比例得分等。探讨GILT在乳腺癌中的作用。3.乳腺癌组织中GILT表达情况与患者预后的关系收集患者确诊乳腺癌后3年的随访资料,明确患者出现复发、转移的具体部位及时间,以及患者死亡的具体原因及时间。根据患者乳腺癌组织中GILT蛋白的表达情况,对患者的预后情况进行分析,利用单因素分析,明确GILT蛋白表达对患者无病生存期（disease-free survival, DFS）及总生存期（overall survival, OS）的影响；进一步通过亚组分析,明确不同亚组情况下GILT对患者预后的预测价值；多因素COX回归模型分析,明确GILT能否作为一种独立的预后指标,预测乳腺癌患者的早期复发转移及生存状况。4.免疫组织化学法检测正常组织-乳腺癌原发灶-淋巴结转移灶间质中FOXP3表达情况及FOXP3+淋巴细胞比例对44例腋窝淋巴结转移乳腺癌患者的正常组织——原发灶——淋巴结转移灶石蜡组织切片分别进行FOXP3免疫组织化学染色。通过前述方式及标准进行间质细胞FOXP3蛋白表达水平的判定。5.统计学分析利用卡方检验比较乳腺癌组织与正常乳腺组织GILT表达的差异；利用卡方检验及Fisher确切概率法检验GILT表达情况与常见临床、病理因素之间的关系,Kaplan-Meier法及log-rank检验评价GILT对DFS及OS的影响,多因素COX回归模型计算GILT作为独立预后指标的风险比及95%可信区间,Spearman法分析乳腺实质GILT表达情况与间质FOXP3表达情况的相关性,所有检验结果均为双侧,P<0.05认为有显著性统计学差异。结果1.乳腺癌组织GILT蛋白表达缺失率明显高于正常乳腺组织本研究218例乳腺癌组织中,有34例出现GILT表达缺失,表达缺失率为15.6%（34/218）,而99例正常组织中,仅有2例出现GILT表达的缺失,表达缺失率为2.02%（2/99）,乳腺癌组织中GILT表达缺失率明显高于正常组织（P<0.001）。提示GILT表达的缺失可能参与乳腺癌疾病过程。2.乳腺癌组织GILT蛋白表达与临床、病理因素有关本研究中218例乳腺癌患者,癌组织GILT表达强度与患者的肿瘤增殖指数Ki67（P=0.0115）、3年复发、转移率（P=0.0001）及死亡率（P=0.001）呈现负相关,即癌组织中GILT阴性组Ki67指数明显升高,3年复发、转移发生率及死亡率明显增加；乳腺癌组织中GILT表达范围及免疫组化染色总得分与患者Ki67、3年复发、转移率及死亡率亦呈现出明显的负相关（P<0.05）。即GILT低表达患者Ki67指数更高,更易在3年内出现复发、转移及死亡等不良预后。本研究未发现与其他临床、病理因素之间的相关性。此结果表明：乳腺癌组织中GILT表达的缺失可能与乳腺癌细胞的增殖相关,并有可能是影响乳腺癌患者预后的一个重要因素。3.乳腺癌组织中GILT蛋白表达的降低影响患者预后,是3年DFS及OS的独立预测指标乳腺癌组织中GILT蛋白表达水平与患者的早期复发、转移及死亡存在相关性：乳腺癌组织GILT低表达患者的3年无病生存率及总生存率明显低于GILT高表达乳腺癌患者,生存曲线分析结果表明GILT表达阳性（强度得分≥1分；范围得分≥2分；总得分≥3分）的患者较GILT表达阴性（强度得分=0分；范围得分<2分;总得分<3分）患者预后更好,3年内复发、转移及死亡事件的发生率比例更低（P<0.005）。为进一步明确乳腺癌组织GILT表达情况对于DFS及OS的独立预测价值,进行多因素COX回归分析,结果表明,与病理TNM分期、肿瘤大小及淋巴结状态一样,GILT蛋白表达缺失及下调均为乳腺癌早期复发、转移及死亡等不良预后的独立预测指标。因此,免疫组织化学法评价的乳腺癌组织GILT表达情况可以作为乳腺癌患者早期复发、转移及总生存状况的独立预后指标。为了进一步明确各种治疗方式及常见临床、病理因素对GILT预后预测价值的影响,通过DFS及OS亚组分析,结果表明,在所有亚组中GILT低表达患者（包括GILT染色强度、范围及总得分）较高表达患者3年复发、转移率及死亡率更高,风险比（HR）均大于1。其中,当亚组分析GILT表达情况对患者DFS影响时发现,年龄在45-60岁之间、病理TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、激素受体阴性、HER2阴性、Ki670-14%等亚组中,GILT蛋白表达缺失及下调对早期复发转移的影响更明显,即在这些亚组中GILT作为早期复发、转移独立预后指标的预测价值更高。在分析GILT表达情况对患者OS的影响时发现,年龄在45-60岁之间、病理TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、激素受体阳性、HER2阴性、未行放疗、给予紫杉类化疗等亚组中,GILT蛋白表达缺失及下调对死亡事件的影响更明显,即在这些亚组中GILT作为总生存状况的独立预后指标的预测价值更高。4. FOXP3阳性淋巴细胞比例与正常-原发灶-转移灶的疾病过程存在线性趋势,与乳腺癌组织GILT表达情况相关44例腋窝淋巴结转移患者的乳腺正常组织——原发灶——淋巴结转移灶间质中的FOXP3染色结果显示：间质细胞FOXP3表达强度（P<0.001）、范围（P<0.001）及总分（P<0.001）三组之间均存在显著性差异,且间质细胞FOXP3蛋白表达强度、FOXP3+淋巴细胞比例与正常组织-原发灶-转移灶疾病进展过程存在线性趋势,即随着该疾病进程的发展,FOXP3蛋白表达增强、阳性淋巴细胞比例升高（P<0.001）。淋巴结转移灶中GILT表达情况与FOXP3阳性淋巴细胞比例存在相关性。结论1.乳腺癌组织GILT蛋白低表达是乳腺癌早期复发、转移及总生存期的独立预后指标。2.乳腺癌组织GILT蛋白低表达与患者Ki67高有关。3.GILT表达缺失可能参与肿瘤的免疫逃逸过程。创新性及意义1.本课题通过检测乳腺正常组织、乳腺癌原发灶及淋巴结转移灶中GILT的表达情况,分析其与临床病理因素及预后的关系,明确GILT表达与乳腺癌早期复发、转移及总生存期存在相关性,是一个有发展前景的、可靠的乳腺癌早期复发、转移及总生存状况独立预后指标。2.本课题将乳腺癌组织中GILT蛋白的表达情况与间质中FOXP3阳性的淋巴细胞比例联系起来,据此研究GILT蛋白表达缺失参与免疫逃逸过程的可能性。