一、研究背景原发性肝癌最常见类型为肝细胞肝癌，它在全球最致命癌症中排名第三，仅次于肺癌和胃癌。全球每年有750,000新发病例，肝细胞肝癌还是全球第六常见肿瘤，在其检测和治疗方面，目前仍存在着非常大的争议。小肝癌治疗效果非常好，但是由于肝癌的隐匿性较高，临床症状不明显，临床诊断的大部分肝癌患者，都已发展到肿瘤晚期，对晚期肝癌有效的治疗手段非常有限。从分子生物学角度来看，肝癌是高度异构型肿瘤。越来越多的研究表明，肝癌的复杂性和临床多样性，主要是由于基因在疾病发生和发展的过程中的变异越来越多。有文献报道，肝癌的发生和发展是由于各种细胞通路的异常激活，比GSK-3β-C/EBPα-miR-122-IGF1R、HDGF-related protein-3、FoxM1/ACP5、JAK/Stat等等。而且，有研究表明JAK/Stat细胞通路在肝癌的发展过程中起着非常重要的作用，通过抑制JAK/Stat通路，对肝癌的治疗起着非常重要的作用。因此，鉴别新的肝癌的分子调控机制，目前已作为肝癌治疗的重要的研究领域和热点。二、研究目的本研究旨在研究染色体结构维持蛋白4(structural maintenance of chromosome4,SMC4)在肝癌细胞侵袭和增殖中的重要作用及其调控机制。三、材料和方法1.原发性肝癌组织、癌旁组织、正常肝脏组织各72例，均来自原发性肝癌患者标本。Real-time PCR、western blotting和IHC检测SMC4在肝癌组织和细胞中的表达水平。利用统计学方法分析SMC4的表达水平与患者临床参数之间的关系。2.为了研究SMC4在肝癌中的作用，首先合成3个干扰片段和1个阴性对照，并利用real-time PCR和western blotting技术筛选出SMC4的最佳干扰片段。构建的SMC4干扰载体(homo-830)，利用转染技术转染到肝癌细胞中进行深入研究。利用细胞划痕修复实验和侵袭实验，研究SMC4在肝癌细胞侵袭中的作用；细胞克隆形成实验和WST-1实验，检测SMC4在肝癌细胞增殖中的作用。3.利用生物信息学软件对SMC4的3’UTR进行分析，结果发现miR-219与SMC4有两个结合位点。利用real-time PCR技术检测miR-219在肝癌组织和肝癌细胞中的表达情况。将miR-219的模拟物和抑制物，分别转染到97-H和HepG2细胞中，利用real-time PCR和western blotting技术检测SMC4在肝癌细胞中表达情况的变化。荧光素酶报告基因技术，分析miR-219与SMC4结合活性。4.通过PIPs和Donime软件对SMC4的下游调控因子进行分析，结果提示JAK2/Stat3为SMC4潜在的下游调控位点。利用real-time PCR和western blotting技术对JAK2/Stat3在肝癌细胞和组织中的表达情况进行分析。通过转染SMC4干扰载体(homo-830)，利用real-time PCR和western blotting分析SMC4和JAK2/Stat3之间的调控关系，免疫共沉淀技术检测Stat3的磷酸化位点。最后，通过干扰miR-219的表达变化，利用westernblotting技术研究miR-219与JAK2/Stat3之间的调控关系及Stat3的磷酸化情况。四、统计学方法利用SPSS16.0进行统计学分析。两样本均值组间比较采用t检验，SMC4的表达水平与临床参数之间的关系采用U检验，计量资料用均数±标准差来表示，P<0.05有统计学意义。五、结果1. Real-time PCR和western blotting结果均提示，SMC4在肝癌组织和细胞中的表达明显上调，相对于正常对照组；免疫组化结果也提示，SMC4在肝癌组织中的表达明显上调。统计学结果得出，SMC4在肝癌中的表达水平与肿瘤大小、细胞分化、TNM分期和血管侵犯有关，而与患者的年龄、性别和肿瘤类型无关。预示着SMC4的表达水平可能与肝癌患者的不良预后有关。2. Real-time PCR和western blotting结果提示，homo-830为SMC4的最佳干扰片段。细胞划痕修复实验和细胞侵袭实验结果提示，与转染空载体和未转染组相比，转染SMC4干扰载体组的肝癌细胞其迁移率明显降低；细胞克隆形成实验表明，实验组中肝癌细胞增殖率明显降低；WST-1实验结果提示，转染SMC4干扰载体后，肝癌细胞的增殖率由100%下降到73.4%。因此，以上实验结果提示：SMC4在促进肝癌细胞的增殖和侵袭过程中起着非常重要的作用。3. miR-219在4组肝癌细胞和肝癌组织标本中的表达明显下调。当miR-219模拟物和抑制物分别转染到97-H和HepG2细胞中，real-time PCR和western blotting检测结果均提示：miR-219沉默后，会导致SMC4的表达明显上调；而且miR-219表达增强后，也会导致SMC4表达的显著下调。荧光素酶报告基因实验结果也提示，miR-219和SMC4之间存在着负向调控关系。4. Real-time PCR和western blotting实验结果提示，在基因水平和蛋白水平，JAK2/Stat3在肝癌细胞和组织中的表达水平均明显上调。SMC4干扰载体(homo-830)转染到97-H和HepG2细胞中，real-time PCR和western blotting实验结果均提示，无论在基因水平，还是蛋白水平，JAK2/Stat3的表达都随着SMC4的降低而降低。免疫共沉淀实验结果显示，p-Stat3的磷酸化位点为第705号酪氨酸，而第727号丝氨酸的表达无显著变化。Western blotting结果提示，在97-H和HepG2细胞中，miR-219与JAK2/Stat3也存在着负向调控关系，酪氨酸的表达也随着发生变化。六、结论SMC4在肝癌中表达明显上调，其表达水平与肿瘤大小、细胞分化、TNM分期和血管侵犯有关；SMC4能够促进肝癌细胞的增殖和侵袭；本研究第一次完整研究了肝癌中新的调控通路：miR-219-SMC4-JAK2/Stat3(Tyr705)，及其在促进肝癌发展中的作用。