菟丝子为旋花科植物南方菟丝子Cuscuta australis R.Br.或菟丝子Cuscuta chinensis Lam.的干燥成熟种子,性温,味甘,归肝、肾、脾经,具有补肾益精、养肝明目、止泻、安胎等功效。菟丝子炮制历史悠久,酒炙品为菟丝子最早使用的炮制品,明代陈嘉谟总结了“入盐走肾脏”的炮制归经理论后,盐炙品被广泛应用至今。前期本课题组对菟丝子盐炙前后补肾作用进行了比较,发现盐炙后菟丝子补肾作用增强,并通过进一步研究比较了盐炙、酒炙品补肾作用的异同。菟丝子生品具有保肝明目作用,但炮制后是否影响其保肝作用,且菟丝子不同炮制品保肝的原理等尚不明确。本课题为国家自然基金项目中的一部分内容,旨在比较菟丝子生品、盐炙品及酒炙品的补肝作用,比较炮制前后菟丝子保肝作用的异同;以药效学研究为基础,结合代谢组学分析手段,研究菟丝子生品及炮制品的保肝作用原理;并对菟丝子生品及炮制品的药代动力学进行研究,建立PK-PD结合模型,分析炮制对菟丝子在肝损伤大鼠体内代谢的影响。目的:1.研究比较菟丝子炮制前后黄酮及多糖类化学成分的变化。2.研究比较菟丝子生品、盐炙品和酒炙品对CCl4化学性肝损伤大鼠的保肝作用及原理。3.研究比较菟丝子生品、盐炙品和酒炙品对酒精性肝损伤大鼠的保肝作用及原理。4.基于UPLC-MS信号构建代谢组学模型,评价菟丝子对CCl4所致化学性肝损伤大鼠保肝的作用机制。5.建立同时测定血浆样品中绿原酸、金丝桃苷和紫云英苷的UPLC-MS/MS的分析方法。6.研究菟丝子生品、盐炙品和酒炙品的药代动力学及药效动力学,比较三种炮制品中主要药效成分在CCl4肝损伤模型大鼠体内的药代动力学参数及浓度——效应——时间关系曲线的异同。方法:1.采用紫外分光光度法测定菟丝子生品、盐炙品和酒炙品的总多糖及总黄酮含量;采用HPLC法测定菟丝子三种炮制品中主要单体黄酮含量;采用多糖PMP柱前衍生化、HPLC检测方法测定菟丝子三种炮制品多糖部位中的单糖组成。2.以腹腔注射CCl4植物油溶液造成大鼠急性化学性肝损伤模型,灌胃给予菟丝子三种炮制品总提取物,以血清生化指标、肝脏病理切片、肝组织匀浆指标对菟丝子生品和炮制品对化学性肝损伤的保肝药效进行评价,比较不同炮制品的保肝作用异同。3.以灌胃给予高纯度食用乙醇造成大鼠急性酒精性肝损伤模型,同时灌胃给予菟丝子生品、盐炙品和酒炙品总提取物,以血清生化指标、肝脏病理切片、肝组织匀浆指标对菟丝子生品和炮制品对酒精性肝损伤的保肝药效进行评价,比较不同炮制品的保肝作用异同。4.采用CCl4肝损伤模型,基于UPLC-MS信号进行血浆代谢组学分析,运用多元统计分析、医学统计分析等方法寻找菟丝子保肝作用的相关代谢产物,对菟丝子的保肝作用通路及原理进行分析。5.采用UPLC-ESI-MS/MS方法,建立同时测定大鼠血浆样品中绿原酸、金丝桃苷和紫云英苷含量的方法,并进行方法学考察。6.运用所建立的测定绿原酸、金丝桃苷和紫云英苷大鼠血浆样品的方法,对菟丝子生品、盐炙品和酒炙品进行CCl4急性肝损伤大鼠的药代动力学研究,分析菟丝子及其炮制品的药代动力学参数。7.采用CCl4急性肝损伤大鼠模型,研究菟丝子生品、盐炙品和酒炙品的药效动力学,并结合药代动力学建立PK-PD模型,分析不同炮制品的浓度——效应——时间关系曲线。结果:1.制备菟丝子盐炙品和酒炙品,炮制后菟丝子质地变酥脆,颜色变深,具有香气。测定菟丝子生品、盐炙品和酒炙品总多糖含量分别为5.74±0.19%、8.50±0.22%、10.37±0.38%;总黄酮含量分别为 3.20±0.07%、3.70±0.09%、3.69±0.10%;金丝桃苷含量分别为 3.86±0.09mg/g、4.16±0.11mg/g、5.03±0.03mg/g;紫云英苷含量分别为0.56±0.01mg/g、0.83±0.00mg/g、0.78±0.01mg/g;槲皮素的含量分别为 0.05±0.00mg/g、0.09±0.00mg/g、0.08±0.00mg/g。菟丝子盐炙和酒炙后多糖的单糖组成基本没有变化,生品及两种炮制品的多糖部位单糖组成均以甘露糖为主,约占多糖总量的50%以上。2.大鼠腹腔注射40%CCl4植物油溶液后,其肝脏病理切片出现细胞水肿,变性,汇管区扩大,可见炎性细胞浸润;血清ALT和AST值与正常组相比明显升高,有统计学差异,说明造模成功。菟丝子生品给药组肝脏病理切片显示肝脏细胞水肿变形程度较模型组减轻,有部分炎性细胞浸润。菟丝子盐炙品组和菟丝子酒炙品组,肝脏结构更趋向于正常组,细胞未见明显肿胀,有少量炎性细胞浸润。血清生化指标显示,菟丝子生品、盐炙品和酒炙品组大鼠血清的ALT和AST含量与模型组相比均有明显下降,说明菟丝子生品、盐炙品和酒炙品对CC14化学性肝损伤大鼠有保肝作用。从肝匀浆抗氧化指标来看,菟丝子生品组SOD及GSH含量与模型组相比无显著性差异（P＞0.05）,MDA含量下降（P＜0.01）。而菟丝子盐炙及酒炙品可以显著改善CCl4引起的SOD及GSH含量降低（P＜0.01）,同时,使MDA含量显著下降（P＜0.01）。从肝匀浆细胞因子水平来看,菟丝子生品组TNF-α和IL-1β水平与模型组相比没有显著性差异（P＞0.05）。盐炙品和酒炙品组与模型组比较大鼠肝组织匀浆TNF-α和IL-1β水平降低,具有统计学意义（P＜0.05）。但盐炙品和酒炙品两组之间并无显著性差异（P＞0.05）。3.大鼠灌胃50%乙醇后,肝脏病理切片显示肝细胞肿胀明显,可见较明显脂肪变性的肝细胞,胞质内出现弥漫性的圆形脂滴,并且模型组大鼠血清ALT和AST值与正常组相比明显升高,有统计学差异,说明造模成功。从病理切片来看,菟丝子生品组肝脏细胞肿胀及脂肪性变有所减轻;菟丝子盐炙品组和菟丝子酒炙品组,肝脏结构更趋向于正常组,细胞未见明显肿胀,肝小叶内偶见脂肪变性的肝细胞。血清生化指标显示,菟丝子生品、盐炙品和酒炙品组大鼠血清的ALT和AST含量与模型组相比均有明显下降,说明菟丝子生品、盐炙品和酒炙品对酒精性肝损伤大鼠有保肝作用。从肝组织匀浆抗氧化指标来看,生品组大鼠GSH含量与模型组相比无显著性差异（P＞0.05）,SOD及MDA含量下降（P＜0.01）,CAT含量升高（P＜0.05）。与模型组相比菟丝子盐炙及酒炙品组SOD、GSH及CAT含量显著升高（P＜0.01）,MDA含量显著下降（P＜0.01）。从细胞因子水平看,与模型组比较,盐炙品和酒炙品组大鼠肝组织TNF-α和IL-1β水平降低,具有统计学意义（P＜0.05）,但两组间比较没有统计学差异（P＞0.05）。而生品组TNF-α和IL-1β水平与模型组相比没有显著性差异（P＞0.05）。4.建立UPLC-Q-TOF/MS分析方法对CCl4急性肝损伤大鼠进行代谢组学研究,经方法学考察,该方法稳定可行。采用OPLS-DA模型对样本进行分析,在正负离子模式下正常组和模型组可以明显区分开,证明CCl4造模成功。对VIP＞1.0的代谢成分进行曼-惠特尼U检验和One-way ANOVA检验,筛选出肝损伤差异性成分（P＜0.05）。根据MSE得到的碎片信息及精确质量数对筛选得到的成分进行鉴定,并通过HMDB,KEGG,METLIN,Massbank和Chemspider进行数据库搜索比对,共筛选出27个差异性化合物。对菟丝子三个炮制品组分别进行统计分析,找到菟丝子生品、盐炙品和酒炙品的保肝作用的潜在生物标记物。并对代谢物进行了通路分析和可视化分析,分析菟丝子生品保肝作用相关的通路主要有 Sphingolipid metabolism、Taurine and hypotaurine metabolism、Glycerolipid metabolism、Fructose and mannose metabolism、Citrate cycle（TCA cycle）。5.建立了同时测定大鼠血浆样品中的绿原酸.、金丝桃苷和紫云英苷的UPLC-ESI-MS/MS方法,三种成分的保留时间分别为3.24min、4.06min、4.32min,检测范围为0.5—300ng/mL,低、中、高两个浓度批内及批间精密度均＜15%,低、中、高三个浓度的准确度均在80～120%的范围内;三种成分的提取回收率和基质效应均在85%～115%之间;样品的稳定性符合规定。6.CC14肝损伤大鼠口服菟丝子生品、盐炙品和酒炙品后,绿原酸、金丝桃苷和紫云英苷在大鼠体内呈二室模型,通过药时曲线可以看出,三种成分的吸收、消除趋势相似,在2小时内即达到最大血药浓度,之后开始逐渐消除。菟丝子生品口服灌胃给药后绿原酸、金丝桃苷和紫云英苷的Tmax分别为1.42±0.38、1.17±0.26、1.04±0.40小时;Cmax为81.34±15.22、48.44±12.54、12.76±4.10μg/L;t1/2 分别为 8.29±1.36、6.63±1.41、5.20±1.82小时;AUC（0-t）为 477.97±30.32、159.85±28.71、49.65±4.85μg/L*h;AUC（0-∞）为 531.42±31.36、177.69±24.88、53.16±6.02μg/L*h。菟丝子盐炙品口服灌胃给药后绿原酸、金丝桃苷和紫云英苷的 Tmax分别为 1.17±0.52、1.00±0.27、0.54±0.29 小时;Cmax为 20.41±4.06、14.54±3.12、3.53±1.69μg/L;t1/2分别为 5.50±1.15、16.08±3.67、35.12±2.78 小时;AUC（0-t）为 96.45±9.73、62.15±13.48、15.81±1.28μg/L*h;AUC（0-∞）为100.43± 9.34、96.78±17.11、40.60±7.74μg/L*h。菟丝子酒炙品口服灌胃给药后绿原酸、金丝桃苷和紫云英苷的Tmax分别为0.83±0.20、1.04±0.51、0.83±0.13 小时;Cmax 为 66.40±13.55、22.32±1.50、13.11±1.09μg/L;t1/2 分别为 11.67±4.36、15.05±3.14、9.18±3.30 小时;AUC（0-t）为 355.41±48.69、106.48±27.68、84.76±12.99μg/L*h;AUC（0-∞）为 488.55±64.39、151.78±38.54、118.02±24.48μg/L*h。绿原酸的相对吸收率为酒炙品＞生品＞盐炙品,金丝桃苷的相对吸收率为生品＞酒炙品＞盐炙品,紫云英苷的相对吸收率为酒炙品＞盐炙品＞生品。7.结合PK-PD模型,菟丝子生品、盐炙品和酒炙品三组中当绿原酸、金丝桃苷和紫云英苷三种成分的血药浓度较高时,大鼠血清生化指标下降也较为明显,在1小时左右药效和血药浓度有较为明显的相关性。结论:1.菟丝子经过炮制后黄酮类及多糖类成分含量增加,但主要黄酮及多糖类组成没有发生变化。2.菟丝子生品、盐炙品和酒炙品对CC14化学性肝损伤模型大鼠和酒精性肝损伤模型大鼠均有保肝作用,且盐炙及酒炙品保肝作用强于生品,但盐炙和酒炙品二者之间保肝作用没有明显差异,盐炙和酒炙品的保肝作用原理可能与抗氧化作用及细胞因子调控有关。3.通过分析筛选出了菟丝子三种炮制品改变化学性肝损伤代谢的潜在生物标记物,三种炮制品的保肝的潜在生物标记物类似,主要为脂质类化合物,此外还有氨基酸、溶血磷脂胆碱、胆汁酸类化合物。分析菟丝子可能是通过改变脂质代谢、能量代谢从而产生保肝作用的。3.在CC14肝损伤模型中,菟丝子中绿原酸、金丝桃苷和紫云英苷在大鼠体内呈二室模型,菟丝子三种炮制品药代动力学参数相似,无明显差异。三种成分血药浓度与保肝药效有相关性,可被认为是保肝作用的有效成分。