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第一部分白细胞hTERT、PBMC端粒酶活性与性激素在男性冠心病中的相关性研究研究背景和目的:越来越多的研究表明,人体的衰老与增龄性疾病密切相关,其中年龄是心血管疾病的独立危险因素。细胞的衰老伴随着端粒长度的缩短,端粒长度的稳定可保证染色体的完整性,它被称为细胞寿命的“时钟”;端粒酶是维持端粒长度稳定的一种核蛋白逆转录酶,可以修复细胞分裂复制过程中的端粒损耗。研究发现,冠心病患者白细胞端粒长度明显缩短,然而,尚未揭示白细胞端粒长度与冠心病之间的明确关系。端粒酶包括蛋白组分端粒酶逆转录酶(Telomerase Reverse Transcriptase,TERT)以及RNA组分,冠心病患者白细胞TERT表达水平是否异常,值得进一步的研究;另一方面,人体免疫功能与冠心病的发病机制密切相关,单核-巨噬细胞系统参与了动脉粥样硬化斑块的形成,因此冠心病患者单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear cell,PBMC)的端粒酶活性是否异常,值得探索;此外,已有研究表明冠心病患者血清雄雌激素比例明显失衡,且人端粒酶逆转录酶(hTERT)的基因调控序列中存在雌激素受体控制元件(Estrogen Receptor Control element,ERCe),然而,尚未研究在冠心病患者中,雄雌激素比值与白细胞hTERT基因表达量、PBMC端粒酶活性间是否存在相关性。因此,本研究旨在探索冠心病患者白细胞hTERT基因表达水平、PBMC端粒酶活性是否存在异常,同时探讨血清雄雌激素水平与二者间是否存在相关性。研究方法:1.研究对象:武汉大学人民医院心血管内科男性冠心病患者126例(年龄>45岁),健康同龄对照89例,中青年男性49例(26-45岁),青年男性53例(20-25岁)。2.血清雄雌激素水平及生化指标检测:(1)血清雄激素(Testosterone,T)、雌二醇(Estradiol,E2)水平由德国西门子公司ADVIA centaur XP全自化学发光免疫分析仪及原装配套试剂完成测定;(2)血清TC(总胆固醇,Total Cholesterol)、TG(甘油三酯,Triglycerides)、HDL-C(高密度脂蛋白,Highdensity Lipoprotein Cholesterol)、LDL-C(低密度脂蛋白,Low-density Lipoprotein Cholesterol)等生化指标均由德国西门子公司ADVIA2400全自动生化分析仪及配套试剂完成测定。3.白细胞端粒酶相关指标检测:(1)提取白细胞总RNA检测人白细胞hTERT基因表达水平;(2)PBMCs分离计数后采用Roche端粒酶活性检测试剂盒,检测单个核细胞端粒酶活性;(3)提取PBMCs DNA,利用单色多通路荧光定量法检测端粒长度(T/S)。研究结果:1.冠心病患者组血清T水平、血清T/E2比值显著低于各对照组(P<0.05)。2.冠心病组患者白细胞hTERT基因相对表达量及PBMC端粒酶活性显著低于各对照组(P<0.05)。3.冠心病临床分型中,AMI组患者白细胞hTERT基因相对表达量显著低于SA组(P<0.05);4.冠心病组患者PBMCs端粒长度与同龄对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。5.相关性分析中,年龄与白细胞hTERT基因表达水平、PBMC端粒酶活性、PBMC端粒长度、血清T水平、T/E2比值呈负相关关系(P<0.05);血清T/E2比值与白细胞hTERT基因表达水平、PBMC端粒酶活性、PBMC端粒长度呈正相关关系(P<0.05)。6.多因素回归分析中,血清T/E2比值与PBMC端粒酶活性呈正相关(P<0.05)。研究结论:冠心病患者外周血白细胞hTERT基因的相对表达量、PBMC端粒酶活性、雄雌激素的比值均降低;白细胞hTERT基因表达量在不同冠心病临床分型中存在差异;在冠心病患者白细胞端粒长度的缩短可能来源于粒细胞端粒长度的变化;雄雌激素平衡假说可能与冠心病患者外周血白细胞端粒缩短的机制相关,可能通过对PBMC端粒酶活性的调节参与了人体免疫细胞功能的调控。第二部分雄雌激素协同作用促HUVECs hTERT表达抑制P53-P21衰老通路研究背景和目的:本课题前期研究表明,男性冠心病患者白细胞端粒酶逆转录酶(Telomerase Reverse Transcriptase,hTERT)基因表达水平、单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear cell,PBMC)端粒酶活性与血清雄雌激素水平具有显著的相关性。人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)是经典的心血管疾病研究细胞模型。利用人脐静脉内皮细胞的复制性衰老模型,作为增龄性疾病—冠心病的细胞学实验模型,可观察细胞端粒长度及人端粒酶逆转录酶基因表达量的变化情况。且大量研究表明P53-P21通路是经典的衰老通路之一,与复制性衰老密切相关,同时P53与hTERT相关的信号通路存在相互作用。因此,本研究在细胞学模型传代过程中端粒长度及hTERT基因表达量变化情况的基础上,探索雄雌激素协同作用是否能在衰老的脐静脉内皮细胞模型中对细胞端粒长度、hTERT基因表达量及P53-P21通路进行调节。研究方法:1.选取人脐静脉内皮细胞作为体外研究对象。2.细胞自然传代后得到1-18代细胞模型,通过在细胞模型中给予DMSO,睾酮(1×10-8mol/L),雌二醇(5×10-6mol/L),雄雌激素(1×10-8mol/L;5×10-6mol/L,比值为20:1),干预后与空白组进行对比,检测细胞中端粒酶逆转录酶基因表达水平、端粒长度、人端粒酶逆转录酶蛋白水平及P53、P21蛋白水平。研究结果:1.人脐静脉内皮细胞自然传代至第12代后,细胞端粒长度缩短(P<0.05),端粒酶逆转录酶基因表达水平下降(P<0.05)。2.随着人脐静脉内皮细胞复制性传代,端粒酶逆转录酶蛋白水平下降,P53、P21蛋白水平上升(P<0.05)。3.雄雌激素协同作用下,13-15代衰老的人脐静脉内皮细胞端粒酶逆转录酶基因表达水平上调(P<0.05),端粒酶逆转录酶蛋白水平上调(P<0.05),P53、P21蛋白水平下调(P<0.05);第15代细胞端粒长度增加(P<0.05)。研究结论:人脐静脉内皮细胞的复制性衰老过程中,细胞端粒长度明显缩短,人端粒酶逆转录酶基因及蛋白表达水平显著下降,细胞周期蛋白P53、P21发生堆积。雄雌激素协同作用能够延长衰老脐静脉内皮细胞端粒长度,促进衰老的人脐静脉内皮细胞端粒酶逆转录酶基因及蛋白水平表达,减少P53、P21蛋白的堆积。