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研究背景:慢性骨髓增殖性疾病(Chronic myeloploliferativedisorders,CMPDs)是一种克隆性造血干细胞疾病,以骨髓中一系或多系细胞过度活化和外周血中成熟细胞数量增多为特征。WHO认定的CMPDs包括:慢性粒细胞性白血病(Chronic myelogenousleukemia,CML)、慢性嗜中性粒细胞性白血病(Chrinic neutrophileleukemia,CNL)、慢性嗜酸性粒细胞性白血病(和高嗜酸性粒细胞综合症)[Chronic eosinophilic leukemia(and the hypereosinophicsyndrome),CEL/HES]、真性红细胞增多症(Polycythemia vera,PV)、原发性血小板增多症(Essential thrombocythemia,ET)、慢性特发性骨髓纤维化(伴髓外造血)[Chronic idiopathic myelofibrosis(withextramedullary hematopoiesis),CIMF]、未分型的慢性骨髓增殖性疾病(Chronic myeloproliferative disease,unclassifiable,UCMPD)。尽管WHO对MPDs亚型有严格的的诊断标准,但对于精确的分类仍有困难,在某些情况下很难与反应性骨髓增生相鉴别。只有CML存在特异性的分子生物学标记BCR-ABL融合基因,并认为该融合基因是CML慢性期一个原发的、也可能是唯一的发病因素。近二年国外的研究结果表明,在绝大多数的PV,以及将近半数的ET或IMF患者中存在JAK2V617F基因突变,这种发生在JAK2假激酶区(pseudokinase domain)(具有自身抑制活性的高度保守区域)的突变,可导致JAK信号转导途径持续活化,而JAK2的自身激活可使其下游的的信号转录传导和激活因子(signal transducerand activator of transcription,STAT)磷酸化,磷酸化的STAT5转移至细胞核与DNA-STAT5结合位点结合,从而促使细胞增殖基因的转录,使得髓系造血祖细胞对各种生长因子及其受体高度敏感。本课题以38例PV,12例ET,14例CIMF,20例CML,1例CNL和5例UCMPD为研究对象,使用PCR产物测序及等位基因特异性PCR方法测定各型MPDS患者JAK2V617F突变,并对磷酸化JAK/STATs信号蛋白的表达进行研究观察,以进一步揭示CMPD发病的分子机理,结合JAK2 V617F突变存在与否并综合观察、分析相应的骨髓增殖性疾病患者的临床特点,探讨JAK2 V617F突变对MPDS诊断、鉴别诊断及预后判断中的价值和意义。第一部分慢性骨髓增殖性疾病JAK2V617F突变鉴定目的:获得中国人种骨髓增殖性疾病患者JAK2V617F突变发生的百分率;比较DNA序列测定和等位基因特异性PCR测定在检测JAK2V617F突变的敏感性和特异性,确定一种简单可靠的基因突变检测方法。方法:所有病例均常规抽取外周血5至10ml,分离中性粒细胞,用酚氯法抽提基因组DNA,并用前向引物5′-TCCTCAGAACGTTGATGGCAG-3′和反向引物5′-ATTGCTTTC-CTTTTTCACAAGAT-3′进行PCR扩增,扩增后的PCR产物纯化后进行碱基序列测定。同时应用两条前向引物(内参照前向引物:5′-ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG-3′和特异性前向引物:5′-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3′)和一条共同的反向引物:(5′-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3′)进行等位基因特异性PCR,将等位基因特异PCR结果与DNA测序结果进行比较,从而确定等位基因特异PCR在JAK2V617F突变检测中的敏感性和特异性。结果:在90例慢性骨髓增殖性疾病患者用常规的PCR产物测序方法检测到43例突变(38例真性红细胞增多症中有32例突变,突变率为84.2%;14例慢性骨髓纤维化患者中有6例突变,突变率为42.8%;12例原发性血小板增多症患者中有5例突变,突变率为41.7%,20例慢性粒细胞白血病中无1例突变,突变率为0%;5例未定型的慢性骨髓增殖性疾病和1例慢性嗜中性粒细胞白血病中未发现有突变)。采用等位基因特异性PCR方法则检测出有49例MPDS患者存在JAK2V617F突变,该突变并经过正反测序得到进一步确定。结论:中国人种的慢性骨髓增殖性疾病患也存在JAK2V617F突变,该突变见于绝大多数PV患者和将近半数的ET和CMIF患者,突变的发生率与西方人种近似;等位基因特异性PCR检测JAK2V617F突变较PCR产物直接测序具有更高的敏感性和阳性检测率,值得在临床上推广应用。第二部分JAK2、磷酸化的JAK2和STAT5在JAK2 V617F突变的MPDS外周血粒细胞的表达分析目的:为进一步揭示具有JAK2 V617F突变的CMPDs的分子发病机理。我们比较了JAK2V617F突变阳性和JAK2V617F突变阴性的CMPDs患者外周血粒细胞中JAK2蛋白、磷酸化JAK2及磷酸化STAT5蛋白的表达,观察是否JAK2 V617F突变启动或激活了JAK/STATs信号转导途径。方法:抽取49例JAK2V617F突变阳性CMPDS患者和41例JAK2V617F突变阴性的CMPDs患者的肝素抗凝外周血5-10ml,常规分离单个核细胞,提取细胞总蛋白,用Western印迹技术分别检测其JAK2及磷酸化JAK2、磷酸化STAT5蛋白表达水平。结果:具有JAK2V617F突变的MPDS患者JAK2蛋白的表达水平与JAK2V617F突变阴性的MPDS患者无显著性差异;但磷酸化的JAK2及磷酸化的STAT5蛋白表达在JAK2V617F突变阳性的MPDS患者较JAK2 V617F突变阴性的MPDS组显著性增高(P＜0.05)。结论:JAK2V617F突变阳性的CMPDs患者存在磷酸化JAK2/STAT5信号转导途径的活化,这一活化可能使得JAK2发生自身激活并促使JAK2/STAT5磷酸化,从而传递细胞增殖信号。第三部分具有JAK2V617F突变阳性的骨髓增殖性疾病患者的临床特点及意义分析目的:比较分析49例具有JAK2V617F突变阳性和15例JAK2V617F突变阴性的的CMPDs的临床特点,分析JAK2V617F突变对MPDS诊断、鉴别诊断及预后判断的意义。方法:按WHO诊断及分型标准进行诊断和分型,常规行JAK2 V617F突变的检测,并回顾性调查记录初诊时患者的外周血血细胞计数,B超检查的脾脏大小,皮肤瘙痒症状以及血栓性事件的发生率。结果:JAK2V617F突变阳性的MPDS患者发病时的白细胞计数与JAK2V617F突变阴性的MPDS患者无显著性差异(P＞0.05)。但JAK2V617F突变阳性患者发病时血红蛋白增高明显,脾脏肿大更显著,且发病的年龄偏大,发生血栓性事件概率增加,而JAK2V617F突变阴性的MPDS患者似乎更易出现皮肤瘙痒。结论:有JAK2 V617F突变的MPDS患者与无JAK2V617F突变的MPDs患者比较有以下特点:发病年龄偏大,起病时平均血红蛋白浓度较高,患病过程中易并发血栓栓塞性事件,但皮肤瘙痒的症状发生率相对较低,其机制尚待进一步研究。