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目的：1.建立检测移植受者外周血淋巴细胞(PBLs)主要组织相容性复合体(MHC)mRNA表达的实时荧光定量聚合酶链反应(Real Time PCR) 的方法；2.通过动态连续检测宿主PBLs MHC-I基因和蛋白水平的表达，揭示移植受者PBLs MHC-I在急性移植排斥反应过程中的变化规律，探讨其表达与同种异体移植急性排斥反应发生进程的对应关系；3. 通过检测不同免疫抑制剂单一和/或联合用药情况下，宿主PBLs MHC-I/-Ⅱ mRNA表达的变化，探索免疫抑制剂剂量与宿主PBLs MHC基因表达之间的关系；并分析MHC-I mRAN表达与环孢霉素A(CsA)血药浓度之间的关系，探讨移植受者外周血淋巴细胞MHC-I mRAN的表达能否作为评估机体免疫抑制程度的监测参数，从而为指导临床免疫抑制剂的个体化用药提供依据；4. 通过与目前学术界己证实的移植排斥反应的无创性指标(外周血淋巴细胞HLA-DR、FasL)进行比较，探讨Real Time PCR方法检测移植受者外周血淋巴细胞MHC-I mRNA表达作为监测急性移植排斥反应无创性指标的可行性，筛选诊断AR的敏感指标。
方法：1.Real Time PCR检测方法的建立。依据GenBank中小鼠MHC mRNA序列，根据MHC-I/-II基因外显子4、5中的保守序列自主设计筛选引物；以管家基因β-actin作为内参照，设计引物。运用SYBR Green I嵌合荧光Real Time PCR定量检测技术扩增MHC mRNA的表达；2.在第一部分(外周血淋巴细胞MHC-I与急性排斥的研究)研究中，将225只SPF(Specific Pathogen Free，无特殊病原菌)级近交系C57BL/6小鼠(组织相容性基因： H-2b)和BALB/C小鼠(组织相容性基因： H-2d)随机分为2组。对照组(n=30， 30只正常健康的BALB/C小鼠作为皮肤移植术前对照)；实验组(n=195，移植未用药)：包括Ea组(n=65，同种异基因移植BALB/C组， H-2b to H-2d)，Eb组(n=65，同种异基因移植C57BL/6组， H-2d to H-2b)和Ec组(n=65，同种同基因移植组， H-2d to H-2d)。其中各实验组根据采血时间不同又分为术后不同时间组，每组5只小鼠。采用经典的小鼠皮肤移植排斥模型，标准方法进行皮肤移植手术。对上述各组分别采用实时荧光定量PCR方法连续检测移植受者PBLs MHC-I(包括H-2K，H-2D)、MHC-II(包括H-2Ia，H-2Ie)和FasL mRNA表达水平的变化，流式细胞术检测CD8+T细胞MHC-I类抗原(H-2K)和MHC-II类抗原(H-2Ia)的表达，H-E常规病理切片连续监测移植物发生排斥反应的组织学改变，并记录病理分级情况与排斥反应发生的时间。 3.在第二部分(免疫抑制剂剂量对外周血淋巴细胞MHC-I表达的影响)研究中，首先，本实验研究了不同剂量免疫抑制剂对非移植手术小鼠PBLs MHC基因表达的影响。将90只SPF级近交系BALB/C小鼠随机分为4组。对照组(n=20，包括10只正常健康的BALB/C小鼠作为用药前对照组和10只给予安慰剂处理的小鼠作为实验对照组)和实验组(n=70，包括环孢素A(CsA)单一用药组，强的松(Pred)单一用药组，CsA和强的松联合用药组)；同时以上各实验组又包括不同剂量组：10mg/kg/day，20 mg/kg/day，40 mg/kg/day，60mg/kg/day，80 mg/kg/day，每组5只小鼠。对上述各组分别采用实时荧光定量PCR方法检测用药的非移植小鼠PBLs MHC-I(H-2K，H-2D)和MHC-II(H-2Ia，H-2Ie)mRNA表达水平的变化，探索可引起宿主PBLs MHC-I基因表达下降的免疫抑制剂剂量，荧光偏振免疫分析法(FPIA)检测不同剂量CsA血药浓度的变化；其次，本实验还研究了不同剂量免疫抑制剂对移植手术小鼠PBLs MHC基因表达的影响。将285只SPF级近交系C57BL/6小鼠(组织相容性基因： H-2b)和BALB/C小鼠(组织相容性基因： H-2d)随机分为2组：对照组(n=30，30只正常健康不用药的BALB/C小鼠作为移植术前对照)和实验组。其中，实验组(n=255，移植用药组)包括：Ea组(n=85，同种异基因移植小剂量用药组，H-2b to H-2d，CsA 30mg/kg+Pred 30mg/kg)、Eb组(n=85，同种异基因移植大剂量用药组，H-2b to H-2d，CsA 60mg/kg+Pred 60mg/kg)和Ec组(n=85，同种同基因移植用药组，H-2d to H-2d， CsA 30mg/kg+Pred30mg/kg)。其中各实验组根据采血时间不同又分为术后不同时间组，每组5只小鼠。
结果：1.实验小鼠一般情况和移植物肉眼观察以及组织病理学改变全部存活的实验小鼠一般状况良好，体重略有增加。同种同基因(同系)移植小鼠呈现移植耐受状态，无排斥现象发生，移植物的大体观察及组织病理学检查与移植前相比均无明显改变。与同系移植组不同，同种异基因(异系)移植小鼠均出现严重的排斥反应。当皮肤移植物变黑、变硬，边缘翘起，出现组织坏死，皮片面积缩小至原来的60％以上时，定为完全排斥。肉眼观察移植未用药BALB/C品系和C57BL/6品系组小鼠发生完全排斥的时间均为术后第11天左右，皮肤移植物平均存活时间(MST)为8.20±1.04，而移植用药小剂量组小鼠皮肤移植物发生完全排斥的时间为移植术后第18天左右，移植物MST为17.05±1.17，移植用药大剂量组小鼠皮肤移植物发生完全排斥的时间是移植术后第25天左右，移植物MST为25.08±1.11，与移植未用药小鼠相比，差异有统计学意义(P＜0.05)；2. 移植受者PBLs MHC mRNA表达在急性移植排斥反应过程中的变化规律；3.流式细胞术检测结果显示，当排斥反应发生时，异系移植未用药组小鼠CD8+T细胞H-2K、H-2Ia抗原平均荧光强度(MFI)与术前对照组相比呈升高表达趋势，但差异不明显；4. 对PBLs MHC-Ⅰ mRNA表达与其他公认的移植排斥反应的无创性指标进行比较，结果显示：与同系移植(未用药和用药)非排斥组相比，异系移植(未用药和小剂量用药)排斥组小鼠PBLs H-2Ie(相当于人类HLA-DR))mRNA表达显著升高(P＜0.05)分别出现于移植术后第11天和第15天。同样，PBLs FasLmRNA表达排斥组较非排斥组也明显升高(P＜0.05)，分别出现于移植术后第9-13天和第15天左右，对应排斥病理分级的Ⅲ-Ⅳ级；5.不同剂量免疫抑制剂对非移植手术小鼠PBLs MHC基因表达影响的结果；6.不同剂量免疫抑制剂对移植手术小鼠PBLs MHC-I mRNA表达影响的结果。当排斥反应发生时，与对照组相比，小剂量和大剂量CsA和强的松联合用药异系移植组小鼠PBLs MHC-I mRNA表达均升高，但大剂量组PBLs MHC-I mRNA升高表达出现的时间明显晚于小剂量组，而且升高的幅度也比小剂量组低。
结论：1.Real Time PCR方法连续动态检测移植受者外周血淋巴细胞MHC-I(尤其H-2K基因位点)mRNA表达有助于早期发现急性移植排斥反应的发生；2.大样本的动物实验，研究发现：移植受者外周血淋巴细胞MHC-I mRNA表达上调与急性移植排斥反应密切相关；3.移植受者外周血淋巴细胞MHC-I mRNA在排斥反应的早期阶段，呈稳定性高表达，且检测窗口期长，优于其它的诊断指标(MHC-II，FasL)，可作为诊断早期移植排斥反应的无创性指标。