研究背景帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种以中脑黑质多巴胺（Dopamine,DA）神经元变性丢失为主要病理特征的神经退行性疾病,临床症状以进行性运动障碍为主。PD的患病率随年龄增长而增加,中国的发病例数约占全球的一半。PD不仅给患者家庭带来巨大的经济负担,也显著降低了病人及家属的生活质量。因此寻找治疗PD的理想方法显得愈加迫切。PD的病因病机尚不明确,但线粒体功能障碍可引起PD已得到广泛认可。PINK1蛋白主要定位于线粒体发挥作用,其基因突变和蛋白功能缺陷均可引起线粒体功能障碍,导致PD。现有大量研究显示,PINK1与下游的Parkin蛋白构成的PINK1/Parkin通路,可调节线粒体分裂和融合,但具体的调控机制仍待研究。PD尚无有效根治的方法,基于整体观念和辨证论治理论体系的祖国医药,可针对PD的多个靶点起到治疗作用,明显改善PD患者症状,不良反应小,具有独特的优势。因此,进一步探讨中药的作用机制,寻求治疗PD更为有效的方法,具有重要意义。我们前期的研究证实由大补阴丸和牵正散组成的补阴牵正方可改善PD模型小鼠脑线粒体功能,也可维持PD细胞模型线粒体质量。在此基础上,本研究基于pink1基因进一步探讨补阴牵正方对PD中线粒体质量的分子调控机制。研究目的以pink1基因为切入点:①揭示补阴牵正方对PD细胞和动物模型中线粒体形态和功能的保护作用,阐明补阴牵正方对PD线粒体的这一保护与pink1基因调控的相关性。②从PINK1/Parkin通路与线粒体分裂、融合蛋白之间的密切联系,进一步探寻补阴牵正方保护PD线粒体形态和功能的靶点和分子机制。为临床应用中药防治PD以及中药的进一步开发运用提供科学依据。研究方法本研究主要分为细胞和动物两部分实验。第一部分为细胞实验,包含实验一至实验三。实验一 SH-SY5Y细胞pink1过表达模型构建。酶切连接构建pink1过表达质粒后,扩增提取及测序鉴定,然后采用脂质体介导法瞬时转染SH-SY5Y细胞,使用荧光倒置显微镜、流式细胞分析仪、qPCR和Western Blot技术检测其pink1过表达基因转染效果。实验二补阴牵正方对pink1过表达PD细胞模型线粒体形态和功能的影响。CCK-8法检测各组细胞的存活率;利用MitoTracker（?）Red CMXRos探针标记技术,激光共聚焦扫描显微镜观察各组细胞线粒体的形态和活性;荧光素酶法检测各组细胞线粒体ATP水平;利用Tetramethylrhodamine methyl ester探针标记技术,激光共聚焦扫描显微镜观察并检测细胞线粒体膜电位。实验三补阴牵正方对pink1基因过表达PD细胞模型线粒体分裂/融合的影响。Western Blot技术检测PINK1和Parkin蛋白的表达;免疫荧光双标技术分别检测细胞Parkin蛋白与PINK 1蛋白的共定位关系、Parkin蛋白与线粒体的共定位关系;Western Blot技术检测线粒体融合蛋白1（Mitofusin 1,Mfh1）、融合蛋白2（Mitofusin 1,Mfn2）和视神经萎缩蛋白（Optic atrophy 1,OPAl）及线粒体分裂动力相关蛋白1（Dynamic related protein 1,Drp1）和线粒体分裂蛋白 1（Mitochondrial fission protein 1,Fis1）的表达。第二部分为动物实验,包含实验四至实验七。实验四C57BL/6J小鼠脑pink1过表达模型构建。构建pink1过表达腺相关病毒载体,利用脑立体定位技术注射其载体进入C57BL/6J小鼠左侧纹状体。采用激光扫描共聚焦显微镜观察EGFP的表达情况,qPCR和Western Blot技术检测小鼠脑内pink1 mRNA和PINK1蛋白的表达,鉴定pink1基因过表达效果。实验五补阴牵正方对脑pink1过表达PD小鼠的防治作用。爬杆和抓握实验检测小鼠行为学;免疫荧光技术观察小鼠中脑黑质酪氨酸氧化酶（Tyrosineoxidase,TH）阳性神经元数量;高效液相电化学法检测小鼠前脑DA及其代谢产物含量。实验六补阴牵正方对脑pink1过表达PD小鼠线粒体形态和功能的影响。电镜观察中脑黑质神经元的超微结构;比色法测定脑线粒体复合物I活性;荧光素酶法检测脑ATP含量;JC-1法检测脑线粒体膜电位水平。实验七补阴牵正方对脑pink1过表达PD小鼠线粒体分裂/融合的影响。Western Blot技术检测脑内PINK1和Parkin的表达;免疫荧光双标技术分别检测黑质内PINK1蛋白、Parkin蛋白与线粒体外膜蛋白TOM20的共定位关系;Western Blot技术检测脑线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2和OPA1和线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1的表达。研究结果1.克隆质粒中目的基因序列与原基因序列一致,pink1过表达质粒构建成功。与正常对照组相比,pink1过表达组和阴性对照组可明显检测到绿色荧光蛋白;pink1过表达组的pink1 mRNA和PINK1蛋白的表达都显著提高。说明SH-SY5Y细胞pink1过表达模型构建成功。2.MPP+可造成SH-SY5Y细胞存活率下降,线粒体碎裂,线粒体活性、ATP含量以及线粒体膜电位降低,补阴牵正方和pink1过表达能够拮抗MPP+造成的这些损伤,二者联用这一作用增强。3.补阴牵正方和pink1过表达均能够显著改善MPP+造成的PINK1、Parkin蛋白、线粒体融合蛋白Mfn1/2的表达降低;还可抑制线粒体分裂蛋白Drp1蛋白表达升高;可降低Parkin蛋白与线粒体以及Parkin蛋白与PINK1蛋白的共定位,且二者联合处理时,这一作用增强。此外,补阴牵正方可明显拮抗MPP+造成的OPA1表达降低和Fis1蛋白表达升高,但单独的pink1过表达此作用不明显。4.克隆质粒中目的基因序列与pink1基因序列一致,pink1过表达腺相关病毒构建成功。在纹状体注射后,阴性对照组和脑pink1过表达组小鼠纹状体均见明显绿色荧光,且pink1过表达组脑pink1 mRNA和蛋白的表达较正常对照组和空载对照组都显著提高。说明C57BL/6J小鼠脑pink1过表达模型构建成功。5.pink1过表达和补阴牵正方可明显拮抗MPTP造成的C57BL/6J小鼠协调运动障碍,黑质TH阳性神经元数量的减少及前脑DA含量的降低;联合pink1过表达处理时,上述拮抗作用均增强,对MPTP造成的PD小鼠前脑多巴胺代谢产物DOPAC含量的减少也有明显改善作用。6.补阴牵正方和pink1过表达均可明显拮抗MPTP造成的PD小鼠黑质神经元和线粒体的损伤、脑线粒体膜电位和ATP含量的减低;此外,补阴牵正方可明显拮抗MPTP造成脑线粒体复合物I活性降低,联合pink1过表达处理,这一拮抗作用增强。7.补阴牵正方和pink1过表达均能够显著改善MPTP造成的C57BL/6J小鼠脑PINK1蛋白和Parkin蛋白表达降低,二者联用效果更好。补阴牵正方和pink1过表达还并可降低中脑黑质PINK1和Parkin蛋白与线粒体外膜标志蛋白TOM20的共定位。pink1过表达和补阴牵正方均能够显著改善PD小鼠脑线粒体融合蛋白Mfn1/2和OPA1表达降低,线粒体分裂蛋白Drpl和Fis1蛋白表达的升高。联合pink1过表达处理时,补阴牵正方可增加PD小鼠脑线粒体融合蛋白Mfn1/2蛋白的表达,降低线粒体分裂蛋白Fis1蛋白的表达。结论1.中药补阴牵正方和pink1过表达在离体和整体水平均可以通过增加PINK1蛋白表达,调节PINK1/Parkin通路,进而维持线粒体分裂融合的动态平衡,发挥对PD线粒体形态和功能的保护作用。补阴牵正方在pink1过表达的情况下,能更好的发挥防治PD的保护作用。2.补阴牵正方治疗PD的作用机制与pink1基因有密切关系,补阴牵正方可能通过上调PINK1蛋白表达进而调节PINK1/Parkin通路以及线粒体融合和分裂相关蛋白表达,以改善线粒体形态和功能、保护线粒体质量,从而发挥最佳神经保护作用。