前言肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)是成人最常见的肾脏恶性肿瘤,近年来肾癌流行病学数据显示,肾癌特别是肾细胞癌的发病率呈逐年上升趋势。由于复杂的发病特点及遗传学、组织学的多样性,肾细胞癌缺乏临床上特异性的分子诊断标记物。因此,临床上针对肾癌的早期诊断,预后评价,术后跟踪及靶向治疗效果判定等方面仍然缺乏有效手段。近年来,针对肾细胞癌发生发展的相关机制研究显示,以抑癌基因VHL突变失活及其下游缺氧诱导因子HIF-VEGF分子通路激活为基础的缺氧诱导新生血管形成机制是最重要的肾癌分子病理基础之一。同时,针对肾癌的代谢组学相关研究提示,在低氧状态下,肾细胞癌的能量代谢网络重构可能是肿瘤发生发展的重要环节。因此,针对肿瘤的代谢调控成为近年来肾癌治疗的热点方向。蛋白质翻译后修饰(Posttranslational modifications,PTMs)是指蛋白质在翻译后经历的共价加工过程,通常是通过对其特定的氨基酸残基加上修饰基团或经蛋白水解剪去基团的过程。PTMs通过调节蛋白质的活性、稳定性、亚细胞定位以及蛋白质间相互作用,促进了蛋白质的功能多样性,是扩大基因编码、调节细胞生理功能的有效机制,并与几乎所有已知的细胞通路和疾病相关。随着质谱技术的不断发展,越来越多的PTMs类型被鉴定出来。有证据表明,蛋白质翻译后修饰在不同的生物过程,如细胞的调节分化和有机体的发育以及多种物质代谢等过程中发挥着至关重要的作用。异常的蛋白质翻译后修饰可能与包括肿瘤在内的多疾病密切相关。赖氨酸琥珀酰化修饰是新近发现的一种蛋白质翻译后修饰类型,是琥珀酰基供体通过酶学或者非酶学的方式将琥珀酰基团共价结合到赖氨酸残基的过程。琥珀酰化是通过酶学或者非酶学的方式将一个负电荷四碳琥珀酰基团共价结合到赖氨酸残基的伯胺上的过程。相较于甲基化和乙酰化等修饰,琥珀酰化可以传递更大的结构基团并诱导蛋白电荷出现更大的改变。因此,蛋白质的赖氨酸琥珀酰化修饰可能促进蛋白质的结构和功能发生更加明显的实质性改变。目前通过质谱技术鉴定分析,许多代谢酶包括糖酵解,三羧酸循环、脂肪酸代谢的关键酶都发生了琥珀酰化修饰。这可能提示琥珀酰化修饰广泛参与了与能量代谢相关的生物过程,并发挥了重要的调控作用。但蛋白质赖氨酸琥珀酰化修饰对蛋白质的具体调控机制仍然不够明确。目前针对琥珀酰化修饰对肿瘤进程的作用也少有报道。因此,本研究拟通过对肾细胞癌组织的蛋白组与赖氨酸琥珀酰化修饰组的鉴定和分析,探讨肾细胞癌组织中琥珀酰化修饰的表达水平及其对肾癌能量代谢过程的潜在作用,为肾细胞癌的诊断及靶向治疗提供新的思路和方向。方法一、样本收集(一)肾细胞癌组织样本收集本研究对肾细胞癌组织样本的收集获得了中国医科大学附属第一医院伦理委员会的批准和支持。我们共收集了9对肾细胞癌及与之对应的癌旁组织用于LC-MS/MS的鉴定分析,10对肾细胞癌及癌旁组织液氮冻存标本,以及45对肾细胞癌及癌旁组织石蜡包埋标本。这些标本取自2015年9月至2017年12月在中国医科大学附属第一医院泌尿外科接受手术治疗的肾细胞癌患者。所有患者术前均签署了科研知情同意书。所有患者术前均未接受任何治疗,所有标本术后病理诊断均为肾透明细胞癌。(二)细胞培养本研究培养了OSRC、769-P、ACHN肾癌细胞系,细胞系均来自中国医科大学附属第一医院泌尿外科研究所。二、检测方法(一)蛋白质组和赖氨酸琥珀酰化修饰组的定量分析利用LC-MS/MS技术鉴定肾癌及癌旁组织中的蛋白组表达,定量差异表达蛋白;利用琥珀酰化泛抗体富集,经LC-MS/MS鉴定琥珀酰化修饰组的表达,定量差异表达位点及相关蛋白。(二)差异蛋白组及差异琥珀酰化修饰组的富集和功能分析通过GO、KEGG pathway对鉴定到的差异蛋白及差异表达的琥珀酰化修饰位点进行功能富集,明确差异蛋白尤其是差异的琥珀酰化修饰可能参与的生物学过程。(三)分析差异蛋白组及差异表达的琥珀酰化修饰位点的相关性构建蛋白-蛋白的相互作用网络,标准化差异琥珀酰化修饰位点,明确差异蛋白及差异琥珀酰化修饰位点的相关性,筛选出潜在的作用靶点。(四)检测PGK1及PKM2在肾细胞癌组织中的表达通过Oncomine数据库和TCGA数据库提取分析PGK1及PKM2的基因水平表达。Western blot检测肾细胞癌组织中PGK1及PKM2蛋白的表达。(五)分析PGK1蛋白的临床意义免疫组化检测肾细胞癌组织中PGK1的原位表达情况,分析PGK1蛋白表达水平与肾细胞癌组织病理分级的相关性。(六)检测PGK1的琥珀酰化修饰在肾细胞组织中的表达免疫沉淀富集肾细胞癌组织及癌旁组织中PGK1蛋白,利用琥珀酰化泛抗体检测PGK1的琥珀酰化修饰的表达水平。(七)细胞水平检测PGK1对肾癌细胞生物行为学的影响利用RNAi技术干扰肾癌细胞系OSRC和ACHN中PGK1的内源性表达,通过CCK8细胞增殖实验检测细胞的增殖能力变化,通过Transwell实验检测细胞的迁移能力变化。(八)检测SIRT5对PGK1的琥珀酰化修饰水平的影响通过Oncomine数据库提取SIRT5基因在肾细胞癌组织中的表达情况。在肾癌细胞系ACHN中过表达SIRT5,应用免疫沉淀富集PGK1,Western blot检测PGK1琥珀酰化表达水平。(九)细胞水平检测Sirt5对肾癌细胞生物行为学的影响通过CCK8细胞增殖实验检测细胞的增殖能力变化,通过Transwell实验检测细胞的迁移能力变化。结果一、肾细胞癌组织中差异蛋白质组和赖氨酸琥珀酰化修饰组的定量分析通过高分辨率LC-MS/MS分析,我们从这9对RCC组织样本中共鉴定出4116个蛋白质,其中3217个蛋白质可以量化。经过阈值筛选,有668种蛋白质在肿瘤组织及癌旁组织中存在差异表达,包括了189个上调和479个下调蛋白。在这9对RCC组织样本中,我们共鉴定到了1090个蛋白质中1668个赖氨酸琥珀酰化修饰(Ksucc)位点,其中844个蛋白中的1238个Ksucc位点被定量。与癌旁组织相比,我们在肿瘤组织中筛选到47个蛋白质中的51个Ksucc位点表达上调,95个蛋白质中的110个Ksucc位点表达下调。二、差异蛋白组及差异琥珀酰化修饰组的富集和功能分析我们通过对差异蛋白组及差异琥珀酰化修饰组的GO富集和KEGG pathway分析,发现上调的琥珀酰化修饰蛋白富集于糖酵解、氨基酸的生物合成和hHIF-1信号通路的相关蛋白。与之相对,琥珀酰化修饰下调的蛋白质富集在碳代谢、TCA循环和脂肪酸代谢等通路过程中。我们进一步对琥珀酰化位点及其对应的蛋白质表达量做了关联分析。筛选出HspB1、FGA、COL6A3、FN、PGK1、PKM等蛋白的琥珀酰化修饰最为显著。需要在组织和细胞水平进一步验证。三、PKM2、PGK1及其琥珀酰化修饰在肾细胞癌组织中的表达及意义通过Oncomine数据库提取的关于PGK1和PKM2基因在肿瘤中的芯片数据,我们发现PGK1和PKM2 mRNA在RCC组织中呈现高表达状态;Western blot检测PGK1和PKM2蛋白在RCC组织中同样呈现高表达状态。免疫沉淀富集PGK1蛋白后应用琥珀酰化泛抗体检测结果显示免疫组化结果显示:PGK1在RCC肿瘤组织中呈现高表达状态,并定位于细胞质与细胞核中。染色评分与RCC病理分级呈显著的正相关。四、细胞水平检测PGK1对肾癌细胞增殖及迁移能力的影响我们通过RNAi技术构建了PGK1特异siRNA,抑制了肾癌细胞系OSRC和ACHN中的PGK1表达水平。CCK8细胞增殖实验结果表明,转染siRNA后,与对照组相比较,OSRC和ACHN的细胞增殖能力明显下降。Transwell细胞迁移实验结果表明,转染siRNA后,与对照组相比较,OSRC和ACHN的细胞迁移能力也明显受到抑制。五、检测SIRT5对PGK1的琥珀酰化修饰水平及对肾癌细胞增殖及迁移能力的影响我们首先通过对Oncomine数据库中肾癌组织基因芯片数据分析,发现SIRT5mRNA在肾细胞癌组织中明显降低。我们在ACHN细胞中构建了SIRT5过表达质粒,上调了细胞的SIRT5内源性表达。通过免疫沉淀富集PGK1,利用泛琥珀酰化修饰抗体检测结果显示:过表达SIRT5的ACHN细胞中,PGK1的琥珀酰化修饰受到明显抑制。CCK8及Transwell实验结果显示:过表达SIRT5后,肾癌细胞的增殖能力和迁移能力均出现显著下降。六、统计分析实验数据均以均数±标准差(x±s)显示,统计分析采用SPSS 16.0软件进行。配对样本数据比较采用配对样本t检验,随机样本组间比较采用独立样本t检验。判定差异有统计学意义的标准设定为P<0.05。结论1、在RCC中,存在较高丰度的赖氨酸琥珀酰化修饰位点,并且其差异表达的蛋白集中于糖酵解、氧化磷酸化、TCA循环、脂肪酸代谢等能量代谢通路中。2、糖酵解关键酶PKM2、PGK1及其赖氨酸琥珀酰化修饰在肾细胞癌中呈现高表达状态。免疫组化结果显示:PGK1在RCC组织中呈现高表达状态,并定位于细胞质与细胞核中。PGK1染色评分与RCC病理分级呈显著的正相关。3、PGK1能够显著影响肾癌细胞的增殖能力和迁移能力。4、SIRT5在肾癌组织中呈低表达状态,并可能通过其去琥珀酰化的酶活性调控PGK1的琥珀酰化修饰,从而影响肾癌细胞的增殖和迁移能力。