论文部分内容阅读
肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，也是世界上各种实体肿瘤中预后效果较差的恶性肿瘤之一，并具有与乙肝、肝硬化等密切联系的疾病特点。因此，癌症的早期预警技术研究对于预防肝癌、预测肝癌的发病趋势具有非常重要的研究价值和社会意义。目前临床上广泛应用的肝癌诊断标志物AFP，对于肿瘤直径小于3cm的肝癌患者其敏感性、特异性均不理想。近几年，国际上许多研究人员发现血清中丰富的多肽资源可以扮演肿瘤标志物这个重要角色，对于肿瘤的早期预警、早期诊断具有重要的研究意义。其中，有报道称多肽Pep5是潜在的肿瘤诊断标志物之一。本论文建立了检测多肽标志物Pep5的ELISA方法，同时应用于肝癌患者的检测分析，评价其诊断肝癌的价值与临床意义。首先我们采用传统的单克隆抗体制备方法成功建立针对Pep5的3株杂交瘤细胞株，即2F6、4F6及7G7，上清抗体的灵敏度均达到10ng/ml。同时制备3种细胞株的腹水抗体，总计41ml，效价均在1:2000000以上。并进行纯化与酶标，共得到纯化抗体28ml，2F6及7F7滴度达0.5ng/ml，4F6为5ng/ml。3种高灵敏度、高特异性的抗体为后续方法建立奠定了基础。应用所制备的抗体，本文分别建立三种检测Pep5的ELISA方法，即直接法、夹心法与竞争法，并分别进行关键条件的优化。直接法优化结果为HRP-2F6浓度1.25ug/ml，血清1:20稀释；夹心法为7G7单抗1:2000包被，HRP-2F6浓度为5μg/ml，血清1:10稀释；竞争法Pep抗原0.5ng包被，HRP-2F6为1:20000稀释，血清1:5稀释。我们使用三种方法分别验证小量样本，其中直接法区分肝癌与正常组效果最好（P<10-6），敏感性93.3%，特异性83.3%。本文分别对优化后的直接ELISA方法的线性范围、检测限、精密性、回收率进行评价。其中在1.5-20ng/ml范围内线性关系良好，检测限为1.24ng/ml，相关系数为0.9959。我们分别取9、12、15ng/ml合成多肽进行检测，得到批内与批间CV为1.44%-6.17%，日内与日间CV为2.89%-4.89%，回收率分别为98.98%，99.61%，101.58%。评价结果表明，优化后的直接ELISA法适用于血清中多肽的检测。最后采用直接ELISA法检测420例临床血清，正常组与肝癌组差异显著（P<0.001）。当Pep5的诊断阈值为7.48ng/ml时，诊断肝癌的敏感性为80.8％，特异性为96.2%。经检测94例肝癌血清时，Pep5的检出率（90.4%）高于AFP（63.8%），两者联合检测检出率可达到94.7%。终上所述，采用直接ELSIA方法检测临床血清中的多肽标志物Pep5，可以明显提高肝癌的检测敏感性，对于肝癌血清学诊断具有重要的研究意义。